劉曉嵐 劉曉慶 荊雪寧 唐妮 景政 孔晉亮 宋志軍 吳紅

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是臨床常見的細菌生物被膜（Biofilms，BF）相關感染致病菌。BF是細菌粘附于活性或惰性物體表面形成的高密度細菌團塊，并由自身產(chǎn)生的粘性胞外基質包裹著的具有三維立體結構的生物群體[1，2]。生物被膜中的細菌對抗生素和宿主免疫攻擊的抵抗能力大大提高，所以BF 的形成給治療帶來很大的困難[3]。而群體感應（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)在BF 感染過程中發(fā)揮著非常重要的調節(jié)和協(xié)調作用。QS是指當細菌數(shù)量達到一定的密度時才能發(fā)生的感應現(xiàn)象，它是一種密度依賴的細菌-細胞間信號機制，由相應的信號分子與受體蛋白結合，在細菌毒力和BF 形成的調控中起著重要作用[4～8]。本實驗采用QS系統(tǒng)完整的PAO1野生型菌株及其同源QS系統(tǒng)的PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株體外培養(yǎng)BF 感染的載體移植到小鼠腹腔，然后觀察群體感應系統(tǒng)的lasR/rhlR基因缺陷對小鼠腹腔銅綠假單胞菌生物被膜感染致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株銅綠假單胞菌PAO1野生型，PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型（丹麥哥本哈根大學醫(yī)院臨床微生物科惠贈）。

1.2 實驗動物8～9 周齡清潔級健康雌性KM 小鼠，體重18～22g，廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號SCXK 桂2014-0002。

1.3 載體將一次性使用引流管（蘇州鑫達醫(yī)療器材有限公司）切割成直徑為5mm 的小圓片，高壓滅菌后使用。PA 在37℃恒溫搖床中培養(yǎng)20h，將細菌濃度調整至所需的OD600=0.05，用24 孔板每孔分別加入2.0ml 調好的菌液或生理鹽水，浸泡無菌的一次性引流管圓片，37℃恒溫培養(yǎng)20h，取出載體，生理鹽水沖洗兩遍備用。

1.4 試劑和主要器材LB 瓊脂、LB 肉湯（均為中國陸橋技術責任有限公司提供），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。全自動血液分析儀（SYSMEX，XT-2000i），智能生化培養(yǎng)箱（常州市偉嘉儀器制造有限公司，SPX250），酶標儀（美國Thermo Multiskan MK3），生物安全柜（蘇州凈化設備有限公司，BHC-1300I-IA/B2），普析通用T6 新世紀紫外可見分光光度計（上海精密科學有限公司），SPX-3003-Ⅱ型生化恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），臺式低溫高速離心機（5410R，德國EPPENDOF）。

1.5 動物分組及模型建立將30 只雌性KM 小鼠標準鼠糧、隨意飲水飼養(yǎng)1周。按照隨機分配原則，分成空白對照組、PAO1野生型組、基因缺陷型組各10 只。將小鼠在4%水合氯醛腹腔0.2ml/只麻醉下，于左下腹部局部消毒后行7～8mm 切口逐層進入腹腔，將載體用無菌生理鹽水輕輕沖洗后放入腹腔，縫合關腹。飼養(yǎng)3d，小鼠眼球后靜脈采血約1.0ml 查血常規(guī)，然后處死小鼠觀測以下指標：腹部細菌學和病理學變化（取出載體并輕柔地去除表面組織，生理鹽水輕柔沖洗后用連續(xù)稀釋法進行活菌計數(shù)；切除載體周圍腹腔感染組織浸泡于10%甲醛溶液中固定，做石蠟切片常規(guī)HE染色、顯微鏡下觀察），分析PAO1野生型和PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型生物被膜體內感染的差異。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 載體活菌計數(shù)比較小鼠腹腔植入載體取出后采用連續(xù)稀釋法計算活菌計數(shù)，結果顯示基因缺陷型組為（5.66±0.14）lg（cfu/ml），少于PAO1野生型組的（5.95±0.26）lg（cfu/ml）（t=2.849，P=0.016），空白對照組未培養(yǎng)出活菌。

2.2 血常規(guī)指標比較基因缺陷型組和空白對照組的白細胞計數(shù)明顯低于PAO1野生型組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017，P=0.024）；基因缺陷型組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）?；蛉毕菪徒M和PAO1野生型組單核細胞比值明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；基因缺陷型組和PAO1野生型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 小鼠腹腔植入載體3d后血常規(guī)指標比較（±s）

表1 小鼠腹腔植入載體3d后血常規(guī)指標比較（±s）

注：與PAO1野生型組比較，aP<0.05；與空白對照組比較，bP<0.05

組別 白細胞計數(shù)（×109/L） 單核細胞比值（%）空白對照組 2.86±0.71a 5.46±1.60 PAO1野生型組 3.61±0.63 10.28±2.62b基因缺陷型組 2.81±0.71a 9.69±2.40b

2.3 腹腔感染組織病理學改變肉眼觀，PAO1野生型組載體周圍網(wǎng)膜、腸管等組織黏連，形成膿腫；基因缺陷型組炎癥反應明顯較輕，黏連少；空白對照組無明顯改變。光鏡下可見PAO1野生型組出現(xiàn)明顯急性炎癥反應，載體周圍組織可見大量中性粒細胞浸潤和少量巨噬細胞，局部可見細胞變性壞死；基因缺陷型組載體周圍組織。中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤，炎性反應明顯較PAO1野生型組輕，無壞死。見圖1～3。

圖1 空白對照組腹腔載體周圍網(wǎng)膜組織

圖2 PAO1野生型組腹腔載體周圍膿腫組織

圖3 基因缺陷型組腹腔載體周圍感染組織

3 討論

銅綠假單胞菌生物被膜感染性疾病是一類廣泛存在、涉及多學科的疾病，臨床上很多慢性感染如：呼吸機相關肺炎、手術部位感染、牙菌斑、燒傷所致傷口感染、尿路感染、醫(yī)院獲得性肺炎等的發(fā)生均與其有關。目前發(fā)現(xiàn)PA 至少存在四種群體感應系統(tǒng)：las、rhl、iqs、pqs，這四種系統(tǒng)交織成一個復雜的多層次調控網(wǎng)絡，每個群體感應系統(tǒng)由相應的信號分子與受體蛋白結合，從而激活與毒力因子、次級代謝和BF 成熟有關的多種基因轉錄，協(xié)調其特定的功能，影響銅綠假單胞菌生物被膜的形成和致病性[9，10]。las 系統(tǒng)即lasI/lasR 系統(tǒng)，能夠調節(jié)多種毒力因子的表達，其中一些物質在BF 的形成過程中有重要作用，如綠膿菌素能夠調控eDNA 的釋放，促進BF 形成，而eDNA 在促進銅綠假單胞菌BF 形成中起重要作用，參與細菌的初始附著、黏連和BF大菌落的形成[9，11]。rhl系統(tǒng)即rhlI/rhlR系統(tǒng)，能夠調控生物表面活性劑—鼠李糖脂和凝集素LecA 等的產(chǎn)生，在BF 形成后期對促進其成熟結構的形成及維持發(fā)揮作用。lasI 和rhlI 基因分別編碼細菌群體感應信號分子，lasR 和rhlR基因分別編碼轉錄激活子調節(jié)信號分子及下游毒力基因等的表達。此外，iqs 系統(tǒng)和pqs 系統(tǒng)也參與了銅綠假單胞菌生物被膜的形成[9，12]。有實驗證明，銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的lasR/rhlR基因是參與調節(jié)成熟的銅綠假單胞菌生物被膜形成的重要組成部分，影響抗生素的作用和宿主免疫功能的清除，能夠調控PA 的體內致病性[6～9]。

本實驗腹腔植入的載體取出后通過計算發(fā)現(xiàn)基因缺陷型組的活菌計數(shù)明顯少于PAO1野生型組，說明相對于PAO1野生型，機體更容易清除PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株。BF 形成可以幫助它在外界環(huán)境中更好的生存，這是一個極其復雜的防御過程。小鼠腹腔感染后基因缺陷型組和空白對照組的白細胞計數(shù)相近，均明顯低于PAO1野生型組，說明PAO1野生型組小鼠機體出現(xiàn)明顯的全身炎癥反應表現(xiàn)，而基因缺陷型組沒有出現(xiàn)，反映PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型引起的機體全身炎癥反應明顯弱于PAO1野生型。而且，病理組織學大體觀和鏡下表現(xiàn)也顯示基因缺陷型組的腹腔載體周圍的局部炎癥反應明顯輕于PAO1野生型組。可見，PAO1 lasR/rhlR基因缺陷明顯降低銅綠假單胞菌生物被膜的體內致病性。向青青等[13]曾使用相同的兩種菌株研究銅綠假單胞菌生物膜感染對氣管插管模型大鼠肺組織Foxp3、轉化生長因子β1（TGF-β1）、白細胞介素10（IL-10）表達的影響，結果證實銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的lasR/rhlR基因能促進模型大鼠中PAO1 的炎癥反應，促進肺組織Foxp3表達上調，并伴有TGF-β1、IL-10分泌增多，使病原菌不能被有效清除而長期存在，促使感染遷延化和慢性化，也說明QS系統(tǒng)對免疫系統(tǒng)的Th1/Th2 平衡有一定影響。關于銅綠假單胞菌生物被膜組成和調控的詳細研究可以幫助我們找到能夠有效防治PA 慢性感染的新型藥物和方法。本實驗用QS系統(tǒng)完整的PAO1野生型及其同源QS系統(tǒng)的PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株進行腹腔留置引流管載體相關的銅綠假單胞菌生物被膜感染，比較QS系統(tǒng)PAO1 lasR/rhlR基因缺陷PA 所形成的BF的體內致病性與PAO1野生型菌株的差異。結果顯示PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株與PAO1野生型菌株感染的載體對小鼠的致病能力存在明顯差異，PAO1野生型菌株的炎癥反應明顯更嚴重，小鼠相對更容易清除體內由PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株引起的感染。由此證實QS系統(tǒng)lasR、rhlR基因在PA 及其BF 結構的致病性和耐藥性中占有重要地位。因此如果針對QS系統(tǒng)的lasR、rhlR基因進行銅綠假單胞菌生物被膜感染的防治會有重要的臨床意義。