宮頸癌為常見(jiàn)婦科惡性腫瘤，發(fā)病率較高，全球每年新增病例達(dá)56.5萬(wàn)例，我國(guó)每年確診宮頸癌超過(guò)18.15萬(wàn)例，且近年來(lái)發(fā)病人群呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重危害女性健康。高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染與宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展存在明確因果關(guān)系，但從感染初期至演變?yōu)閷m頸癌需8～10年，至浸潤(rùn)癌則需要再發(fā)展2～5年[2]，但早期缺乏典型癥狀，因此及早通過(guò)篩查診斷并針對(duì)不同階段的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）采取相應(yīng)干預(yù)措施，是控制宮頸癌患病率、改善患者預(yù)后的必要手段。目前宮頸癌篩查多被規(guī)范為“三階梯”診斷程序[3]，第一階梯包括HPV分型檢測(cè)與液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（TCT），目前已有較多研究對(duì)其進(jìn)行報(bào)道，盡管在基層醫(yī)院展現(xiàn)出良好應(yīng)用前景，也具有較好的診斷學(xué)效能[4～6]，但往往僅能篩選出高危人群，對(duì)于評(píng)估病變部位、受累范圍及生物學(xué)行為，仍需借助第二階梯的電子陰道鏡檢查及第三階梯的宮頸組織病理學(xué)活檢。然而活檢術(shù)作為侵入性有創(chuàng)操作，存在一定并發(fā)癥隱患且患者接受度并不高，推廣電子陰道鏡檢查具有必要性。本研究分析HPV分型檢測(cè)、TCT 與電子陰道鏡Reid評(píng)分（RCI）聯(lián)合應(yīng)用于CIN分級(jí)診斷效能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料對(duì)2016年7月～2019年6月在我院接受治療的194例CIN患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：電子陰道鏡下宮頸存在可疑病變，或存在白帶異常、接觸性出血、陰道排液等典型癥狀；年齡≥18歲；有性生活史；2 周內(nèi)完善各項(xiàng)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：健康宮頸；有CIN 病史；有宮頸外科手術(shù)、物理治療、放化療史；其他部位已確診感染高危型HPV；合并妊娠或陰道炎。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集方法 囑患者接受標(biāo)本采集前禁性生活、陰道沖洗或用藥2d，確保月經(jīng)干凈≥3d，取截石位并以鴨嘴型窺器充分顯露宮頸，將多余分泌物拭去，以一次性宮頸細(xì)胞刷置入宮頸管內(nèi)適當(dāng)深度，令刷毛覆蓋病灶或轉(zhuǎn)化區(qū)，以宮頸外口中央為中心，以適當(dāng)壓力沿固定方向刷取，根據(jù)患者病變情況采集5～10周，分為2份標(biāo)本封存于專用保存液。

1.2.2 HPV分型檢測(cè)方法 將上述宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本之一經(jīng)細(xì)胞裂解液、解鏈酶處理后，采用杭州德同生物技術(shù)有限公司提供的HPV 核酸檢測(cè)試劑盒（雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法，DH3），分別將包括14種高危HPV 亞型DNA 單鏈進(jìn)行全長(zhǎng)互補(bǔ)雜交，并依次加入單抗修飾的磁珠、堿性磷酸酶、顯色底物，測(cè)定對(duì)應(yīng)底物發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.3 TCT 方法 將上述另一份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本送入長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司提供的湘智XJ-12 液基薄層細(xì)胞制片機(jī)，通過(guò)過(guò)濾、富集、純化、轉(zhuǎn)移等自動(dòng)化操作，以及乙醇固定、核染色、堿化、胞質(zhì)染色、樹(shù)膠固封等人工操作，制作液基薄層涂片，于高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與染色情況。

1.2.4 電子陰道鏡檢查方法 于標(biāo)本采集相同體位下，以生理鹽水棉球拭去陰道壁過(guò)多分泌物或滲血，采用深圳金科威實(shí)業(yè)有限公司提供的DVIS-C陰道鏡數(shù)字成像系統(tǒng)，觀察宮頸表面轉(zhuǎn)化區(qū)病變情況，調(diào)節(jié)濾光器仔細(xì)觀察其表面血管形態(tài)；棉球蘸取新制5%醋酸后均勻涂抹于宮頸表面，計(jì)時(shí)1min后觀察宮頸上皮；棉球蘸取盧戈氏復(fù)方碘溶液，均勻涂抹于宮頸表面與陰道壁，即時(shí)觀察涂抹區(qū)域著色情況。

1.3 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)HPV分型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中，以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度RLU/CO=1.00 為檢測(cè)閾值，14種高危HPV 亞型DNA 中，出現(xiàn)任一亞型≥1.00，可評(píng)估為高危HPV 陽(yáng)性。TCT 涂片鏡下觀察時(shí)，嚴(yán)格按照Bethesda 系統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)（TBS）[7]。電子陰道鏡檢查過(guò)程中，記錄關(guān)鍵性征象并保存典型圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均錄入SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、百分率（%）表示；采用二元Logistic回歸模型，將宮頸組織病理學(xué)活檢結(jié)果作為因變量（即“金標(biāo)準(zhǔn)”及分組條件，其二分類賦值：0=CINⅠ，1=CINⅡ/Ⅲ），以HPV分型檢測(cè)（二分類賦值：0=高危HPV 陰性，1=高危HPV 陽(yáng)性）、TCT（等級(jí)賦值：0=NILM，1=ASC-US，2=LSIL，3=HSIL，4=SCC）、RCI評(píng)估（等級(jí)賦值：直接以評(píng)分賦值）結(jié)果為協(xié)變量，以Enter 為方法進(jìn)行回歸分析，擬合出概率函數(shù)Logit（P）=4.732×HPV分型檢測(cè)+0.670×TCT+0.874×RCI評(píng)估-6.246，返回保存預(yù)測(cè)概率作為聯(lián)合診斷結(jié)果進(jìn)行診斷效能分析；將各診斷方法結(jié)果繪制受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積（AUC）、置信區(qū)間（95%CI）、靈敏度、特異度、截?cái)啵╟ut-off）值等參數(shù)信息，單純?cè)\斷與聯(lián)合診斷間AUC 比較采用DeLong 檢驗(yàn)；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸組織病理學(xué)活檢結(jié)果194例CIN患者中，確診CINⅠ 109例（56.18%），CINⅡ 47例（24.23%），CINⅢ 38例（19.59%）。

2.2 HPV分型檢測(cè)結(jié)果CINⅠ患者高危型HPV陽(yáng)性率明顯低于CINⅡ/Ⅲ患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 HPV分型檢測(cè)診斷結(jié)果[n（%）]

2.3 TCT結(jié)果CINⅠ患者TCT 惡性程度明顯低于CINⅡ/Ⅲ患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 TCT 診斷結(jié)果[n（%）]

2.4 RCI評(píng)估結(jié)果CINⅠ患者RCI 明顯低于CINⅡ/Ⅲ患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=7.011，P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 RCI評(píng)估結(jié)果[n（%）]

2.5 診斷效能分析HPV分型檢測(cè)、TCT、RCI評(píng)估單獨(dú)診斷CIN的ROC曲線AUC 均明顯小于聯(lián)合診斷，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合診斷CIN的靈敏度與特異度分別為74.12%、97.25%，TCT、RCI評(píng)估診斷CIN的截?cái)嘀捣謩e為≥ASC-US、≥3分，見(jiàn)圖1、表4。

圖1 各診斷方案ROC曲線

表4 ROC曲線參數(shù)

3 討論

目前臨床推薦的治療策略中，CINⅠ多以隨訪觀察、物理治療等保守措施為主，病情具有可逆性，而CINⅡ/Ⅲ病情則不可逆轉(zhuǎn)，需采取手術(shù)治療[8]，故需以宮頸組織學(xué)活檢下CINⅠ、CINⅡ?yàn)榉纸M界限，以分析各檢查方法的診斷價(jià)值。

HPV 屬于小型DNA 病毒，涵蓋40 多種亞型，通常在生殖區(qū)域及肛門發(fā)生感染，臨床將參與宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展的亞型歸為高危型[9，10]。宮頸癌是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的唯一具有確切病因的惡性腫瘤，病理學(xué)研究顯示，HPV DNA 進(jìn)入宮頸上皮細(xì)胞后可誘導(dǎo)編碼表達(dá)E6、E7 等多種致病蛋白，使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，組織增生失控，并抑制免疫應(yīng)答，最終觸發(fā)癌變[11]。本研究顯示，CINⅠ患者高危型HPV 陽(yáng)性率明顯高于CINⅡ/Ⅲ患者，其診斷靈敏度為77.65%，特異度為72.48%，表明HPV分型檢測(cè)對(duì)宮頸癌具有一定的診斷效能，靈敏度較特異度高提示高危型HPV 宮頸上皮感染可能存在一過(guò)性與自限性，僅當(dāng)患者機(jī)體免疫系統(tǒng)存在持續(xù)性缺陷時(shí)，高危型HPV才致病。有學(xué)者提出，雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法相較于全自動(dòng)DNA 提取-熒光定量PCR 法所需檢測(cè)材料更廉價(jià)，適用于經(jīng)濟(jì)與醫(yī)療水平欠發(fā)達(dá)的地區(qū)開(kāi)展宮頸癌初篩，但缺乏靶點(diǎn)優(yōu)選、選擇性擴(kuò)增及實(shí)時(shí)檢測(cè)等高精度質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，其檢測(cè)精度較低，仍需結(jié)合其他檢查協(xié)助診斷[12]。

早期臨床觀察宮頸細(xì)胞學(xué)形態(tài)多采用宮頸刮片，然而該采樣方法難以將病變細(xì)胞完全轉(zhuǎn)移至載玻片，且人工制片可能因操作不當(dāng)而使細(xì)胞發(fā)生變形，加之血細(xì)胞、炎癥細(xì)胞與黏稠分泌物還可干擾鏡下觀察，漏診率相對(duì)較高[13]。相關(guān)研究表明，TCT 采用特制的一次性細(xì)胞刷，刷取宮頸細(xì)胞已有較成熟的操作標(biāo)準(zhǔn)，且通過(guò)自動(dòng)化制片技術(shù)，可提高涂片制作質(zhì)量，光鏡下也能取得良好視野，相較于宮頸刮片可減少50%以上假陰性率[14]。本研究中，CINⅠ患者TCT 惡性程度顯著低于CINⅡ/Ⅲ患者，其診斷靈敏度為83.53%，特異度為54.13%，說(shuō)明由TCT 觀察到的宮頸脫落細(xì)胞細(xì)胞學(xué)形態(tài)與宮頸組織病理學(xué)活檢結(jié)果具有一定相關(guān)性，但考慮到形態(tài)學(xué)評(píng)估存在主觀性，特異度仍不足。有報(bào)道指出，刷取宮頸細(xì)胞后向細(xì)胞保存液中洗脫操作動(dòng)作過(guò)大，可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)于分散或破損，在鏡下表現(xiàn)為異常凝聚征象[15]，將影響觀察及最終診斷結(jié)果，還有待進(jìn)一步改良。

電子陰道鏡屬于雙目光學(xué)窺鏡，由冷光源、光學(xué)攝像機(jī)、監(jiān)視屏、支架及其他輔助元件構(gòu)成，具有高效的立體放大功能，在冷光源照射宮頸及下生殖道時(shí)，可將局部表皮放大10～40倍[16]，清晰成像于監(jiān)視屏上，對(duì)觀察其上皮結(jié)構(gòu)、血管走行/形態(tài)及腺體開(kāi)口等生理、病理特征具有積極意義。醋酸白試驗(yàn)與碘試驗(yàn)是電子陰道鏡診斷宮頸癌的常規(guī)步驟，前者主要運(yùn)用醋酸在不同類型細(xì)胞中角蛋白脫色性與不同類型組織的穿透性，在涂抹后特定時(shí)間對(duì)其延遲脫色情況進(jìn)行觀察可達(dá)到鑒別的目的[17]；而后者則借助分化成熟的鱗狀上皮細(xì)胞含有的糖原可絡(luò)合碘三陰離子被染上深棕褐色，但柱狀上皮、未成熟化生鱗狀上皮糖原含量極少而不能被著色或著色較淺[18]，從而將不同細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)；兩者均可進(jìn)一步提高電子陰道鏡圖像對(duì)比度，更有助于醫(yī)師直觀作出評(píng)估與診斷。然而電子陰道鏡仍屬于依靠圖像外觀的形態(tài)學(xué)技術(shù)，異常圖像異質(zhì)性較大，需要通過(guò)客觀的評(píng)分體系加以改善其特異性。RCI 自20 世紀(jì)80年代提出以來(lái)沿用至今，仍是目前應(yīng)用最多的電子陰道鏡觀察參考標(biāo)準(zhǔn)，將其0分、1～2分、3～4分、5～6分、7～8分分別與宮頸組織病理學(xué)活檢慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌相對(duì)應(yīng)，可取得高達(dá)96.95%的符合率[19]。本研究顯示，CINⅠ患者RCI 顯著低于CINⅡ/Ⅲ患者，且聯(lián)合HPV分型檢測(cè)、TCT 可獲得較單獨(dú)檢查更高的診斷效能，提示三者聯(lián)合診斷能從病毒感染、細(xì)胞學(xué)形態(tài)及上皮病變外觀3個(gè)方面對(duì)宮頸癌及癌前病變進(jìn)展情況作出全面判斷，以完善臨床醫(yī)師對(duì)患者病情的認(rèn)知，利于指導(dǎo)制定治療與隨訪策略。Cholkeri-Singh 等[20]認(rèn)為，病灶暴露深度仍是電子陰道鏡檢查未能克服的困難，尤其絕經(jīng)后婦女雌激素分泌減少，宮頸出現(xiàn)明顯萎縮，轉(zhuǎn)化區(qū)可因此回縮至宮頸管內(nèi)，建議無(wú)雌激素應(yīng)用禁忌證的絕經(jīng)后婦女，在檢查前可進(jìn)行持續(xù)1～2 周的雌激素局部給藥干預(yù)，以降低漏診率。

綜上所述，HPV分型檢測(cè)、TCT 聯(lián)合RCI評(píng)估對(duì)CIN 具有較高的診斷效能，不僅對(duì)早期評(píng)估病情并采取適宜的干預(yù)措施具有指導(dǎo)意義，還可減少不必要的宮頸組織病理學(xué)活檢，改善患者診療體驗(yàn)及預(yù)后，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。