葉精勤,肖葉,陸亦寬,謝慶超,盧瑛*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,201306) 3(農業(yè)農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室,上海,201306)

河豚魚肉質鮮美，但內臟等組織中含有劇毒河豚毒素(tetrodotoxin,TTX),是一種非蛋白類神經毒素[1],也是一種較為常見的海洋生物毒素,屬于氨基全氫喹唑啉化合物,毒性極強,通過選擇性阻斷Na+通道,對中毒者造成神經和四肢麻痹,嚴重者可致呼吸衰竭甚至死亡[2]。TTX最初是由日本學者Yoshizumi Tahara從河豚魚的卵巢中發(fā)現[3],因而命名為河豚毒素。但TTX不僅存在于河豚魚體內,還廣泛存在于蠑螈[4]、海星[5]、雙殼類和腹足類[6]、斑胸鯛(Pleurobranchaeamaculata)腹足類、斑鳩[7]、螃蟹、青蛙、海蛞蝓、星魚、藍環(huán)章魚、絲蟲等動物體內[8]以及細菌[9]如鰻利斯頓氏菌屬(Listeriaanguillarum)、不動桿菌屬(Acinetobacter)[10]、假單胞菌屬(Pseudomonas) 、交替單孢菌屬(Alteromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、希瓦氏菌屬(Shewania)等[11]。這些動物和細菌廣泛分布于太平洋、印度洋[12]、紅海海域[13]和大西洋[14]的溫帶水域。日本、越南、中國東南沿海、意大利[15]、葡萄牙[16]、西班牙、南米格爾島(亞速爾群島)、摩洛哥海岸、馬德拉島和葡萄牙大陸海岸等相關水域也有存在[14]。

1 河豚魚的食用歷史和消費現狀

據《山海經》中記載,我國食用河豚魚的歷史可以追溯到兩千多年前的先秦時期[17],盡管那時已有因食用河豚魚中毒的事情發(fā)生,但河豚魚的美味依舊吸引著人們屢次冒險嘗試。至唐朝時期,宮廷中開始有食用河豚魚的記載,到了宋朝民間食用河豚之風更甚,因而還引得眾多文人墨客留下諸多墨寶,如“河豚常出于春末,群游水上,食絮而肥,南人多以荻芽為羹,云最美”；“快趁兩三杯,河豚欲上來”；“剩買蔞蒿荻筍,河豚已上漁舟”等等。除中國外,日本也是河豚魚消費大國,且食用河豚魚的歷史悠久。據考古資料顯示,出土文物中發(fā)現兩千多年前日本繩文時代就有河豚魚的魚骨出現,可以推定日本至少在繩文時代就食用過河豚魚。直到1200年前的奈良·平安時代,才開始有相關史料記載。當時豐臣秀吉出兵朝鮮,軍中常發(fā)生士兵食用河豚魚中毒死亡的事件。為了避免此類情況繼續(xù)發(fā)生,豐臣秀吉在軍中頒布了禁止食用河豚魚的禁令[18]。

由于河豚魚含有毒性,烹飪操作不規(guī)范或誤食毒素含量較高的內臟組織會引起中毒,為了保證消費者的食用安全,我國從1990年開始禁止食用河豚魚。原衛(wèi)生部在1990年公布的《水產品衛(wèi)生管理辦法》中第三條明確規(guī)定：“河豚魚有劇毒,不得流入市場”[19]。20世紀末,隨著人工養(yǎng)殖河豚魚技術的發(fā)展,人工養(yǎng)殖河豚魚毒性較低甚至達到無毒水平[20]。2016年國家發(fā)布了《關于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經營》的通知(農辦漁[2016]53號),根據聲明對符合條件的企業(yè)開放上述2個品種的河豚魚加工經營[21]。2016年9月,中國漁業(yè)協(xié)會審批并通過了我國第一批河豚魚養(yǎng)殖基地,包括遼寧、河北、山東、江蘇和廣州地區(qū)的12家單位通過審核。經過多年發(fā)展,我國河豚養(yǎng)殖業(yè)基本形成了工廠化和規(guī)?；慕洜I模式,養(yǎng)殖的河豚魚能達到低毒甚至無毒水平。生產企業(yè)可以從養(yǎng)殖到餐飲實現對河豚流通的全鏈條監(jiān)控,以確保讓消費者放心食用[19]。根據2018年《中國漁業(yè)年鑒》顯示2017年河豚魚養(yǎng)殖產量相比2016年同比增長6.13%,達24 403 t[22]。2019年僅揚中地區(qū)日銷河豚就達到10萬t以上,民間每年還有以河豚為主題的烹飪餐飲比賽,賽事期間每周接待游客可達12萬人次,在增加餐飲營業(yè)額的同時也帶動了當地的旅游文化產業(yè)的發(fā)展[23]。

2 養(yǎng)殖河豚魚的加工利用現狀

自晉代開始,民間就有烹制河豚魚的方法,最初是選用簡單蒸煮的方法,后來逐漸出現添加荻芽做成的羹湯,其中以腹部的肉做得羹湯最為鮮美,稱之為“西施乳”,而后又有河豚面、燉河豚、河豚醬等不同的河豚類菜肴出現[17]。自我國2016年河豚魚有條件解禁后,河豚魚菜品種類和式樣也不斷創(chuàng)新,如河豚餃子、河豚肝刺身等[23]。近些年來,隨著食品加工行業(yè)和生物醫(yī)藥行業(yè)的興起,市場上又出現了很多河豚魚相關的深加工產品,經過精深加工的河豚魚,售價高達數百美元,是直接出口河豚魚的10多倍，有河豚魚干[24]、河豚魚肉松、河豚魚肉丁、河豚魚酒、河豚魚皮、河豚魚油、河豚魚濃湯、河豚魚飲品等與河豚相關的調味品和調味醬料以及功能性食品等[26-30],如表1所示。

表1 河豚魚不同部位制成的加工產品Table 1 Processing products made from different parts of puffer fish

河豚魚中含有豐富的揮發(fā)性氣味物質,如醛、烴、芳香類以及含硫含氮化合物,還有氨基酸、核苷酸等滋味活性成分。有研究表明,100 g河豚魚肉的鮮味強度相當于0.37 g味精產生的鮮味[25],不管是做成加工食品還是制成調味品都能充分發(fā)揮其鮮味特點。

由于以豬、牛等哺乳動物為來源的膠原蛋白易受到口蹄疫、瘋牛病等多種感染性疾病的威脅,因而魚皮等水產品的膠原蛋白是替代它們的較好來源。河豚魚皮中膠原蛋白含量較高,提取率相較于其他動物膠原蛋白的提取率更高[26]。任俊鳳[27]先將河豚魚皮制成凍干粉末,采用鹽溶液浸泡法去除非膠原蛋白雜質,然后利用水浴浸提(65 ℃,12 h)結合木瓜蛋白酶酶解法(5 000 U/g,45 ℃,2 h)制備膠原蛋白肽,該方法工藝操作簡單、膠原蛋白肽得率高,提取的膠原蛋白生物活性高。以河豚魚皮為原材料制備得到的膠原蛋白肽和膠原寡肽有很好的生理功效和加工特性,可以起到調節(jié)生物體內酶和激素的作用,改善礦物質的運輸和吸收,具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等功效,廣泛應用于食品和化妝品領域[28,30]。

河豚魚還具有豐富的藥用價值,河豚魚的不飽和脂肪酸含量較高,尤其富含二十二碳六烯酸 (docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA),能阻止膽固醇在血管壁上沉積,預防動脈硬化和心腦血管疾病,有助于增強記憶力和改善思維能力,預防老年性癡呆,有健腦、益腦作用[31]。有研究顯示,河豚肝臟中DHA和EPA分別占脂肪酸總量的1/3和1/15,為常見淡水魚的2倍左右[32],是生產魚油等保健食品的優(yōu)質加工原材料。但由于生產魚油的原料是毒素含量較高的河豚肝臟或卵巢[29],因此為了保證制品的食用安全性,河豚魚油的生產需要嚴格控制TTX的含量。

3 河豚毒素的消減技術

隨著河豚銷售市場的開放和人工養(yǎng)殖河豚魚產業(yè)的發(fā)展,國內的河豚魚需求將會逐漸增加[33]。不管是河豚的烹飪食品還是精深加工河豚魚水產品及相關功能性食品等,河豚魚組織中TTX的有效去除和毒性消減都是至關重要的。目前河豚毒素的消減技術主要分為3類,分別是物理法、化學法和生物法。

3.1 物理法

物理消減TTX的方法主要原理是利用熱力等方法破壞TTX結構達到減毒的效果。劉慶營[34]利用高溫120 ℃,15 min,熱力消減河豚魚肉中的毒素。馮先榮等[35]將腌制后的河豚魚100 ℃蒸煮1 h制成安全可使用的河豚魚粉。傳統(tǒng)烹制河豚魚前去除毒素的步驟中有腌制揉搓和高溫蒸煮操作,能夠去除TTX的原因主要有2方面,一方面腌制揉搓及蒸煮過程中可以使TTX溶出,減少組織中毒素含量；另一方面在高溫蒸煮過程中,TTX會轉化成毒性較低的同系物,有研究表明,100 ℃加熱20 min時,TTX會轉化成脫水河豚毒素,其毒性是TTX的1/500,加熱到6 h時,脫水河豚毒素會進一步轉化成毒性更低的河豚酸[36]。此外,還有利用雙氧水結合光催化劑的方法,將UV+Au摻雜氧化鉛-改性氧化石墨烯結合雙氧水催化的方法消減TTX,反應時間60 min,消減率達95%[37],但是具體的消減機理尚不清楚。

3.2 化學法

化學方法消減多是利用pH堿化以破壞TTX的結構來降解毒性。利用Na2CO3和NaOH堿性試劑去除河豚魚中的TTX,20 ℃下,魚肉塊浸泡1 h即可消減至無毒狀態(tài)。或者在40 ℃,pH為7.0的條件下,用不同濃度半胱氨酸溶液與TTX抽提液混合15 min亦可消減毒性[38]。采用熱堿法(在pH>7,121 ℃條件下)與河豚卵巢作用15 min，可消除卵巢中的毒素，制備抗炎癥藥物[39]。除此之外,TTX在一些介質中還可能與無機鹽發(fā)生基團或靜電結合,向 modified seawater medium(MSWM)添加TTX,混合作用1 d即可去除TTX的毒性。MSWM中含有的P-1 metal solution和硼酸成分對TTX的毒性消減起到主要作用,可能的原因是硼酸在溶液中電離出負離子和帶正電荷的TTX相結合而降低了毒性[40]。

3.3 生物法

利用生物發(fā)酵法消減TTX歷史已久,早在1951年,日本中北部地區(qū)的民間食用河豚魚卵巢就采用米糠發(fā)酵的方法。先用鹽腌制卵巢半年,再加入米糠、醬油、紅辣椒等調料發(fā)酵數年[41]，在長時間的發(fā)酵和腌制過程中,TTX的毒性會有所降低。有研究者認為，毒性降低的原因可能有2點：一是長時間的發(fā)酵和腌制過程可能使TTX溶解并擴散到容器中,濃度被稀釋,從而使得卵巢中的毒性降低[40, 42-44]。有相關研究指出河豚內臟中含有大量的油脂,經過鹽腌制后會鹽析出TTX-脂肪復合物,析出的成分會被米糠吸收,因而使得內臟中TTX含量降低[45];二是發(fā)酵過程中可能有微生物參與作用。向未滅菌和熱滅菌的河豚卵巢中添加一定量的TTX,25 ℃條件下密封儲存24個月,隨著時間的推移,卵巢中的TTX含量有所下降,滅菌卵巢中TTX含量從41 MU/g下降到25 MU/g；未滅菌卵巢中TTX含量從51 MU/g下降到25 MU/g。通過小鼠生物法檢測毒性變化,兩者在儲存24個月后毒性降低沒有顯著性差異,且發(fā)酵過程中pH值一直保持酸性狀態(tài),也排除了堿化可能導致毒性降低的可能,說明卵巢中沒有微生物參與發(fā)酵消減TTX。但由于米糠的添加,米糠中的微生物發(fā)酵會分解卵巢中的蛋白等物質,產生氨基酸等共存物,這些共存物可能會起到延緩毒性的作用[46]。有研究發(fā)現,有機鹽、葡萄糖、有機酸和氨基酸等共存物質可延緩小鼠的死亡時間。綜上,SHIMADA等[47]排除了卵巢中微生物參與作用的可能。

但在米糠發(fā)酵卵巢制品中,人們分離出了多種菌群,其中,乳酸菌群是最優(yōu)勢的菌群,隨著發(fā)酵過程的進行,發(fā)酵品中菌的種類也會逐漸減少[48]。隨著研究的推進,人們發(fā)現微生物也有參與消減TTX的可能。向100 mg/L的TTX溶液中添加40 g酒曲,在30～35 ℃搖床轉速為50 r/min 條件下,混合48 h后的消減率高達90%[49]。為進一步探究微生物對TTX的消減作用部位及機理, TU等[50]首次發(fā)現乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)可以消減TTX,提取EPS結合Cu2O與TTX混合40 min,HPLC檢測消減情況。實驗分成3組,分別是Cu2O組,LeuconostocmesenteroidesN3,LactobacillusplantarumPN05 和LactobacillusrhamnosusPN04 三株菌的EPS組,和胞外多糖結合Cu2O均可有效消解TTX,消減率分別為34.38%,5.96%～28.99%,7.19%～37.81%[50]。EPS能夠有效消減TTX的原因可能是直接與毒素結合也可能是降低毒素活性或阻礙了活性部位的結合。研究發(fā)現,L.mesenteroides和L.rhamnosus的EPS結合Cu2+后,消減TTX的能力更好,是因為L.mesenteroides和L.rhamnosus的EPS是長鏈結構且都有功能基團(O—H,N—H),可與銅結合形成復雜緊密的結構,可通過氫鍵與TTX相結合(如圖1)。根據FTIR紅外的結果,L.plantarum的EPS被甲基化,可使得氧的電荷密度呈負值和TTX羥基中的氫相互作用結合,從而減少溶液體系中的TTX含量。

a-EPS和Cu及TTX結合;b-EPS和TTX相結合圖1 EPS與TTX的結合方式Fig.1 The combination of EPS and TTX

綜上所述,TTX的化學性質很穩(wěn)定,普通的烹飪加工手段很難有效去除毒素?，F有消減TTX的方法可分為2類,一種是通過減少TTX和濃度來減少毒素的攝入；另一種是通過消減降低TTX的毒性。減少TTX濃度主要是通過揉搓或浸煮物理方法,或者通過化合物結合的方式生成TTX復合物使其從溶液體系中分離出來,從而達到消減目的。降低TTX的毒性主要采用高溫或堿性條件,破壞TTX化學結構或將其轉化成毒性更低的同系物；或者通過離子結合阻礙TTX正電荷基團的作用位點從而降低其毒性。相對而言,通過高溫蒸煮和堿液浸泡來消減TTX 的方法更易操作,但會限制河豚魚加工產品的種類,不利于資源再生綜合利用。而利用生物發(fā)酵方法消減TTX雖能達到減毒的目的,但耗時長不利于工業(yè)化生產。當前國內外學者TTX的消減作用機理方面的研究尚處于起步階段,今后有必要探索和開發(fā)更多可有效消減TTX的方法并解析其作用機制,這些基礎研究對河豚魚資源的綜合利用和產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

4 展望

目前國內市場只有養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀可以有條件的合法化食用,河豚魚加工產品有很高的經濟價值和廣闊的市場前景,其加工副產物內臟組織的丟棄也造成了大量的資源浪費和環(huán)境污染。因而TTX毒性的控制是河豚精深加工及加工副產物的無害化處理中需要解決的重點問題。

未來,在TTX消減技術的開發(fā)及TTX消減機理研究上的還應繼續(xù)拓寬廣度和深度。探索TTX的有效控制方法和TTX消減機理,有利于推進河豚魚綜合利用,促進河豚魚在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的產業(yè)化發(fā)展,優(yōu)化我國水產品結構。對河豚魚加工廢棄物的無害化處理技術的研究,可減少環(huán)境污染,對河豚魚加工副產物的二次利用具有重要的現實意義和應用價值,也為今后相關海洋類毒素的消減提供理論支撐和科學依據。