朱琳,郭全友

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海,200090) 2(華威大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,英國(guó),CV4 7AL)

2019年,全國(guó)水產(chǎn)品產(chǎn)量總計(jì)6 480.36萬t,比上年增長(zhǎng)0.35%[1]。較之畜禽類食品,水產(chǎn)品不僅味道鮮美、脂肪含量低,還含有豐富的DHA、EPA、?；撬岬葼I(yíng)養(yǎng)成分,因而受到消費(fèi)者喜愛[2]。然而,水產(chǎn)品具有高水分和高蛋白的特點(diǎn),在貯運(yùn)過程中極易腐敗變質(zhì),其中微生物是引起腐敗的主要原因[3]。鮮魚在捕撈和運(yùn)輸過程中,微生物可通過魚的腮部、體表黏液、破損的表皮和腸道等侵入機(jī)體并不斷增殖,分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),產(chǎn)生胺類、酯類、硫化物等腐臭特征的產(chǎn)物,導(dǎo)致魚肉原有形態(tài)、色澤和風(fēng)味產(chǎn)生劣變[2,4]。這一過程中,魚體內(nèi)只有部分適合生存和繁殖的菌群參與腐敗,并產(chǎn)生腐敗臭味和異味代謝產(chǎn)物,成為該產(chǎn)品的特定腐敗菌[4-5]。

水產(chǎn)品中最常見的腐敗菌包括腐敗希瓦氏菌、明亮發(fā)光桿菌、乳酸菌和假單胞菌[5-7]。腐敗希瓦氏菌屬于革蘭氏陰性好氧菌,能夠產(chǎn)生H2S、三甲胺(trimethylamine,TMA)及生物胺等[6],是大黃魚[8]和大菱鲆[9]等海產(chǎn)品的特定腐敗菌。假單胞菌是冷藏羅非魚[10]和鯉魚[11]等淡水魚的特定腐敗菌。腐敗菌在導(dǎo)致不同魚類腐敗的過程中,初始菌數(shù)和腐敗速率是影響產(chǎn)品貨架期的主要因素,初始菌數(shù)主要與魚類棲息水域相關(guān),而腐敗速率主要由溫度、pH、鹽分和魚種類等因素決定。水產(chǎn)品在加工過程中常采用低溫處理、降低水分活性、酸化、降低氧化還原值和添加防腐劑等措施調(diào)控目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)活動(dòng)[12],因此,選擇高效和針對(duì)性的控菌抑菌手段成為研究熱點(diǎn)。

本文以源自有氧低溫貯藏的大黃魚和羅非魚的特定腐敗菌腐敗希瓦氏菌和假單胞菌為對(duì)象,探究其在底物、溫度、pH和NaCl影響下的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài),采用Gompertz方程擬合生長(zhǎng)曲線,分析環(huán)境因子和強(qiáng)度對(duì)其最大比生長(zhǎng)速率(μmax)和遲滯期(λ)的影響,為深入了解微生物生存的生態(tài)系統(tǒng)變化對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的脅迫作用和響應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ),為靶向抑菌和延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期等提供支撐。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：腐敗希瓦氏菌(Shewanellapulrefaciens)和假單胞菌(Pseudomonasspp.)分別從大黃魚和羅非魚中分離、篩選、鑒定并于4 ℃斜面冷藏。

試劑：胰蛋白胨大豆胨肉湯(tryptone soybean peptone broth TSB)、胰蛋白胨大豆胨瓊脂(tryptone soybean peptone agar,TSA),英國(guó)OXOID；NaCl,上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1 mol/L HCl溶液,深圳市博材達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)(pHS-3C),上海雷磁儀器廠；低溫培養(yǎng)箱(MIR-153,253),日本三洋公司；潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FB),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 接種物的制備

取斜面保藏的菌株接入裝有4 mL生理鹽水的比濁管中,當(dāng)接種量達(dá)到108CFU/g時(shí),依次進(jìn)行10倍梯度稀釋至102～103CFU/g,然后接種到TSB和魚塊中,魚塊接種方法參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究不同底物(TSB、大黃魚、大菱鲆、鯉魚和羅非魚)、pH(4、5、6、7)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、2.0%、3.5%)和溫度(0、8、15、25 ℃)條件下腐敗希瓦氏菌和假單胞菌的生長(zhǎng)曲線和動(dòng)力學(xué)參數(shù),于TSA上計(jì)數(shù)。

研究底物對(duì)菌株生長(zhǎng)影響時(shí),溫度設(shè)定為5 ℃,腐敗希瓦氏菌分別接種在TSB、大黃魚、大菱鲆和鯉魚魚塊上,假單胞菌接種在TSB、鯉魚和羅非魚魚塊上；研究pH和NaCl對(duì)菌株生長(zhǎng)影響時(shí),使用1 mol/L HCl溶液調(diào)整TSB的pH值為4、5、6和7,調(diào)節(jié)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、2.0%、3.5%和5.5%,腐敗希瓦氏菌假單胞菌和接種在TSB中15 ℃培養(yǎng)；研究溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)影響時(shí),調(diào)整TSB的pH值為7,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%,腐敗希瓦氏菌和假單胞菌接種在TSB中分別于0、8、15和25 ℃培養(yǎng)。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線擬合

采用Gompertz方程[14]對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)行擬合。

(1)

式中：t,時(shí)間,h；N(t),t時(shí)的菌數(shù)(CUF/g),初始菌數(shù)N0(lgCFU/g),最大菌數(shù)Nmax(CFU/g);μmax,最大比生長(zhǎng)速率,h-1;Lag,延滯期,h,。

描述溫度對(duì)μmax的影響時(shí)采用Belehradek方程[15]：

(2)

式中：T,攝氏溫度,℃；Tmin,生長(zhǎng)的最低溫度,即在此溫度時(shí)最大比生長(zhǎng)速率為零；b,常數(shù)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS(17.0 version)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及最小顯著差異法分析,當(dāng)P>0.05 時(shí)差異不顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS(17.0 version)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸并求得置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物對(duì)腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)的影響

將接種于不同底物的腐敗希瓦氏菌增殖過程中的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合(圖1),生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。結(jié)果顯示,腐敗希瓦氏菌在大黃魚中生長(zhǎng)的λ最長(zhǎng),在鯉魚和大菱鲆中λ無明顯差別；腐敗希瓦氏菌在鯉魚中的μmax最小,說明在鯉魚中的腐敗速率最慢,在大菱鲆和大黃魚中的腐敗速率接近。

圖1 底物對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of substrate on the growth of S.putrefaciens

表1 底物對(duì)腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 1 Effect of substrate on the growth kinetic parameters of Shewanella putrefaciens and Pseudomonas spp.

將接種于不同底物的假單胞菌生長(zhǎng)過程中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,如圖2所示,生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。結(jié)果顯示,假單胞菌在鯉魚和羅非魚中的μmax和λ均無明顯差異。另外,在鯉魚中,腐敗希瓦氏菌與假單胞菌的μmax相當(dāng),說明2種菌株在鯉魚中的腐敗能力相近,這與許振偉等[16]研究中得出的結(jié)論,鯉魚魚塊中假單胞菌的產(chǎn)量因子略大于腐敗希瓦氏菌一致。

圖2 底物對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of substrate on the growth of Pseudomonas spp.

2.2 pH和NaCl對(duì)腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)的影響

分別接種腐敗希瓦氏菌到pH為4、5、6、7,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、2.0%和3.5%的TSB中,于15 ℃培養(yǎng),結(jié)果顯示pH為4和5時(shí),腐敗希瓦氏菌不生長(zhǎng)。6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(N1～N6)的環(huán)境條件及生長(zhǎng)曲線見

圖3，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)見表2。在所有NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下,pH為7時(shí)的μmax均大于pH為6時(shí)。另外,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)腐敗希瓦氏菌的μmax和λ影響顯著,隨NaCl分量分?jǐn)?shù)升高,μmax整體呈下降趨勢(shì),λ整體呈延長(zhǎng)趨勢(shì),說明NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～3.5%,腐敗希瓦氏菌的增殖力隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而逐漸減弱。

表2 各組環(huán)境條件及其腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Environmental conditions of each experimental group and their growth kinetic parameters

圖3 不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下pH對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of pH on the growth of S.putrefaciens under various NaCl concentrations

分別接種假單胞菌到pH為4、5、6、7,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的TSB中,于15 ℃培養(yǎng),pH為4和5時(shí)假單胞菌不生長(zhǎng)。通過接種假單胞菌到pH為6和7的TSB中,溫度和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同,對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)行擬合得到圖4。表2顯示,在本實(shí)驗(yàn)條件下,pH對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)沒有顯著影響。

圖4 pH對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of pH on the growth of Pseudomonas spp.

修艷輝等[17]的研究發(fā)現(xiàn),pH和NaCl對(duì)腐敗希瓦氏菌的μmax和λ有較大影響,在15和25 ℃環(huán)境下,pH≤5.0時(shí)腐敗希瓦氏菌不生長(zhǎng),與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。儀淑敏等[18]的研究表明,銅綠假單胞菌的最適生長(zhǎng)pH均為5,在pH 2～5下生長(zhǎng)緩慢,在pH 5～8下生長(zhǎng)良好,在pH 8以上生長(zhǎng)緩慢。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異,原因可能是本實(shí)驗(yàn)使用的假單胞菌菌株分離自羅非魚,而羅非魚貨架期終點(diǎn)時(shí),假單胞菌中以熒光假單胞菌為主,其占比遠(yuǎn)大于銅綠假單胞菌[10]。關(guān)于pH對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)的影響的研究則鮮有報(bào)道。

2.3 溫度對(duì)腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)的影響

表3為不同溫度條件下腐敗希瓦氏菌(8、15、25 ℃)、假單胞菌(0、5、10 ℃)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù),圖5為其生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,溫度是影響腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)的重要因素,在本實(shí)驗(yàn)條件下,2種菌株的μmax均隨溫度升高而明顯增加；腐敗希瓦氏菌的λ隨溫度升高小幅縮短,假單胞菌的λ隨溫度升高大幅縮短。使用Belehradek方程描述溫度和2種腐敗菌μmax之間的關(guān)系,腐敗希瓦氏菌：y=0.040 6x+0.055 5,R2=0.983 5; 假單胞菌：y=0.016 2x+0.133 8,R2=0.997 6。結(jié)果表明,溫度與腐敗希瓦氏菌和假單胞菌μmax之間線性關(guān)系的R2分別為0.983 5和0.997 6,均處在 95%置信區(qū)間內(nèi),表明該置信區(qū)間內(nèi)能較好描述溫度與2種菌最大比生長(zhǎng)速率的關(guān)系。

表3 各組溫度條件及其腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Temperature conditions of each experimental group and their growth kinetic parameters

a-腐敗希瓦氏菌;b-假單胞菌圖5 溫度對(duì)腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of S.putrefaciens and Pseudomonas spp.

朱彥祺等[19]以冷藏大黃魚特定腐敗菌腐敗希瓦氏菌為研究對(duì)象,其在5 ℃環(huán)境中生長(zhǎng)趨勢(shì)受到明顯抑制,當(dāng)溫度上升到25 ℃時(shí),腐敗希瓦氏菌的λ顯著縮短,且溫度與λ以及μmax均存在線性關(guān)系；李媛惠[20]對(duì)雞肉中的假單胞菌進(jìn)行了研究,認(rèn)為溫度對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)有一定的影響；范新光[21]研究發(fā)現(xiàn)分離自鮮切西蘭花的假單胞菌μmax隨著溫度的上升而增大,λ隨溫度的上升而減小。本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果與前幾位研究者一致。

2.4 底物、pH、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溫度等因子的相互影響

由表2和表3可知,在溫度為15 ℃不變時(shí),N1(pH 6.0,NaCl 0.5%)和N6(pH 7.0,NaCl 3.5%)在不同的pH和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下有相近的μmax,但λ有顯著差距。另外,在pH 6.0不變時(shí),N3(15 ℃,NaCl 2.0%)、N5(15 ℃,NaCl 3.5%)和S1(8 ℃,NaCl 0.5%)在不同溫度和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下有較為接近的μmax,同時(shí)λ有差距。其內(nèi)在原因有待深入研究,一方面,本實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)進(jìn)行更多的平行實(shí)驗(yàn)來減小誤差,從而加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。另一方面,結(jié)果初步表明,腐敗菌在增殖過程中,溫度、pH和食鹽等因子相互影響,使生長(zhǎng)情況更加復(fù)雜。例如,溫度升高導(dǎo)致腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍變寬,修艷輝等[16]的研究發(fā)現(xiàn)15 ℃時(shí),腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限為NaCl≥7%,25 ℃時(shí),界限升至NaCl≥12%。另外,溫度會(huì)影響水的電離,從而影響底物的酸堿度。鹽濃度對(duì)于pH值也有影響,添加0.2 mol/L NaCl時(shí),糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)的pH值生長(zhǎng)范圍變寬,溫度升高,底物酸度也增加。溫度、水分活度和底物營(yíng)養(yǎng)間存在一定關(guān)系,微生物處在最適生長(zhǎng)溫度時(shí),水分活度范圍最廣,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增多,微生物能夠存活的水分活度范圍變廣[22]。

3 結(jié)論

魚源腐敗希瓦氏菌和假單胞菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、抑制效應(yīng)與能源(如底物)、環(huán)境因子(如溫度、pH)等緊密相關(guān)。本文基于腐敗希瓦氏菌和假單胞菌在不同條件下的生長(zhǎng)數(shù)據(jù),擬合生長(zhǎng)曲線,探究了環(huán)境因子對(duì)兩種腐敗菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明:底物差異對(duì)腐敗希瓦氏菌影響較為明顯,其在大黃魚中生長(zhǎng)的λ最長(zhǎng),在鯉魚中的μmax最小,假單胞菌在鯉魚和羅非魚中的μmax和λ均無明顯差異；pH對(duì)腐敗希瓦氏菌和假單胞菌影響較為顯著,pH為4和5時(shí)兩者均不生長(zhǎng),pH為7時(shí)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)速率高于pH為6時(shí),而假單胞菌生長(zhǎng)無明顯差異；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)影響顯著,在0.5%～3.5%,腐敗希瓦氏菌的增殖能力隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而逐漸減弱；溫度是影響腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)的重要因素,兩種菌株的增殖均隨溫度升高而增強(qiáng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)環(huán)境因子之間能夠相互影響,因此對(duì)于底物、溫度、pH、NaCl相互影響的效果與機(jī)制須進(jìn)行深入研究。

同時(shí),基于水產(chǎn)品自身營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味特性和貯運(yùn)條件等考慮,在設(shè)定腐敗菌調(diào)控因子及調(diào)控范圍時(shí),需充分考慮對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響。例如可考慮結(jié)合冰溫保鮮和氣調(diào)保鮮等物理方法,既能有效延長(zhǎng)貨架期,又能減少對(duì)食品品質(zhì)的不良影響,旨在為靶向抑菌和延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期等提供了參考。