張波,謝廣發(fā),李國(guó)龍,孫國(guó)昌,金建明,朱煒俊,劉菊

1(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州,310018)2(浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 紹興,312028) 3(紹興黃酒學(xué)院,浙江 紹興,312028)4(紹興鑒湖釀酒有限公司,浙江 紹興,312000) 5(會(huì)稽山紹興酒股份有限公司,浙江 紹興,312000)

黃酒是我國(guó)獨(dú)有的、歷史最悠久酒種之一,千百年來(lái)深受人們的喜愛(ài)并流傳至今[1]。浸米是黃酒釀造過(guò)程中的重要環(huán)節(jié),不僅使大米充分吸水膨脹以便于蒸煮,更能使米酸化,來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵醪液的酸度,保障黃酒發(fā)酵安全進(jìn)行[2-3]。傳統(tǒng)浸米工藝時(shí)間長(zhǎng),所釀黃酒生物胺含量高[4]。浸米過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量米漿水,含有大量的氮磷等有機(jī)質(zhì),直接作廢水處理會(huì)給黃酒企業(yè)以及環(huán)境帶來(lái)較大的壓力[5-6]。生產(chǎn)過(guò)程中,因雜菌污染,經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間浸米后得到的米漿水往往會(huì)產(chǎn)生“白花”和異嗅味[7]。這種米漿水直接回用會(huì)給黃酒帶來(lái)不良風(fēng)味,且易引起發(fā)酵醪液酸敗。

近年來(lái),針對(duì)黃酒浸米漿水中微生物群落結(jié)構(gòu)以及米漿水的利用開(kāi)展了大量的研究。由于黃酒自然浸米,米漿水中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，毛青鐘等[8]通過(guò)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法,發(fā)現(xiàn)浸米漿水中含有細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物。通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究黃酒浸米漿水中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)乳酸菌是浸米漿水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,種類繁多且數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢(shì)[9-12]。其大量產(chǎn)酸為發(fā)酵提供酸性環(huán)境,抑制雜菌生長(zhǎng),保證酵母正常代謝[13],而乳酸菌也是產(chǎn)生物胺的主要微生物之一[14-15]。因此如何在滿足浸米產(chǎn)酸需求的同時(shí)減少生物胺的生成是亟需解決的問(wèn)題。目前對(duì)米漿水利用主要是將其作為黃酒生產(chǎn)投料用水,通常會(huì)將米漿水經(jīng)加熱殺菌并冷卻后再使用[16]。然而加熱殺菌和冷卻均會(huì)消耗大量的能源,用量較大時(shí)會(huì)使釀制黃酒中的高級(jí)醇、乙醛等微量有害組分增加[17],且氨基酸態(tài)氮和總酸含量大幅提高,對(duì)產(chǎn)品的安全性和口感造成不利影響。李海霞等[18]將米漿水用于循環(huán)浸米,使米漿水得到部分回用。在實(shí)際生產(chǎn)中,米漿水中乳酸菌多而有害雜菌少時(shí),將老漿用于接種浸米,有利于浸米生酸。但由于自然浸米雜菌易生長(zhǎng)繁殖,用老漿接種浸米很容易產(chǎn)生異嗅味。

本研究模擬自然浸米過(guò)程中乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程,從浸米漿水中篩選出合適的乳酸菌進(jìn)行生物酸化浸米,以消除米漿水異嗅味并降低生物胺含量,進(jìn)一步將米漿水用于循環(huán)浸米和代替部分投料水使用。在保證黃酒品質(zhì)和安全前提下的米漿水循環(huán)利用,對(duì)于減少?gòu)U水排放,實(shí)現(xiàn)清潔化生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,同時(shí)也具有良好的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

糯米、生麥曲、熟麥曲,取自紹興某黃酒廠；安琪活性干酵母。

1.1.2 試劑與儀器

NaOH、NaCl、MgSO4、FeSO4、K2HPO4、CaCO3、CuSO4、檸檬酸銨、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、5-磷酸吡哆醛,L-組氨酸,L-酪氨酸,L-鳥(niǎo)氨酸等,均為分析純,中國(guó)國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

LBI-250恒溫培養(yǎng)箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；G180DS滅菌鍋,致微(廈門)儀器有限公司；E200MV電子顯微鏡,南京尼康江南光學(xué)儀器有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司；UV—5500紫外分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司；KA-1000離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；FE28型pH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、GYP培養(yǎng)基,按參考文獻(xiàn)[19]配制;米飯?zhí)腔号囵B(yǎng)基：糖化液取自紹興某酒廠,用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH為6.2左右,加水稀釋糖度為7～8°Brix,加1%檸檬酸銨；液體脫羧酶培養(yǎng)基,按參考文獻(xiàn)[20]配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 浸米漿水中乳酸菌的分離篩選

稱取100 g糯米加150 mL水于28 ℃浸米3～5 d,過(guò)濾得到米漿水,用無(wú)菌水梯度稀釋到不同濃度(10-1～10-3)并涂布于平板底部,GYP培養(yǎng)基覆蓋,33 ℃條件下培養(yǎng)3 d,根據(jù)有無(wú)透明圈來(lái)初步判斷是否為乳酸菌[21]。挑取透明圈較大的菌落在MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化,并進(jìn)行革蘭氏染色[22]。

1.2.2 乳酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力測(cè)定

將純化后的菌株用MRS培養(yǎng)基于33 ℃活化48 h,取活化菌液以5%接種量接種到米飯?zhí)腔号囵B(yǎng)基中,于33 ℃靜置培養(yǎng)48 h,分別測(cè)定發(fā)酵液OD600值和總酸含量。

1.2.3 低產(chǎn)生物胺乳酸菌的篩選

將浸米漿水中分離出的乳酸菌接種于液體脫羧酶培養(yǎng)基,33 ℃培養(yǎng)96 h觀察顏色變化。然后離心取上清液,采用HPLC法檢測(cè)生物胺含量[20,23],同時(shí)做空白對(duì)照。

1.2.4 乳酸菌的分子鑒定

提取DNA后,進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,由上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),使用MEGA7.0構(gòu)建生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[3, 13]。

1.2.5 生物酸化浸米漿水循環(huán)回用浸米

生物酸化浸米：稱取100 g糯米以料液比1∶1.5(g∶mL)加入水,接種體積分?jǐn)?shù)為5%的乳酸菌種子液,于28 ℃浸米3 d。以自然浸米為對(duì)照,觀察浸米漿水的形態(tài)和品質(zhì),測(cè)定總酸、pH、OD600值。

生物酸化浸米漿水循環(huán)回用浸米：稱取100 g糯米于250 mL三角瓶中(4份),按照料液比1∶1.5(g∶mL),使用生物酸化浸米結(jié)束后,過(guò)濾靜置澄清的米漿水按照體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%的比例代替自來(lái)水開(kāi)始浸米3 d。完成第1次循環(huán)后,將第1次浸米結(jié)束后的浸米漿水經(jīng)紗布過(guò)濾靜置澄清后,按照回用比例用于第2次循環(huán)浸米,以此類推進(jìn)行生物酸化浸米漿水的循環(huán)回用實(shí)驗(yàn),浸米結(jié)束后測(cè)定pH、總酸、OD600值等理化指標(biāo)。

1.2.6 生物酸化浸米米漿水回用釀酒實(shí)驗(yàn)

稱取1 kg糯米,按照料液比1∶1.5(g∶mL)加水,接種體積分?jǐn)?shù)為5%乳酸菌種子液并攪拌均勻,于28 ℃浸米3 d?；赜玫慕诐{水70 ℃保溫30 min。采用常壓蒸煮方式蒸熟米飯后攤開(kāi)冷卻,按米水比1∶1.15(g∶mL)的比例向酒壇中加入投料水(浸米漿水回用比例為20%),加入冷卻的米飯,依次投入生麥曲130 g、熟麥曲30 g、1.5 g活性干酵母(需先活化20 min),均勻攪拌。在29 ℃條件下發(fā)酵,前3 d每天調(diào)低3～4 ℃,到第4天時(shí)溫度調(diào)至15 ℃,保持此溫度直至后酵結(jié)束。前酵階段定時(shí)開(kāi)耙,后酵階段靜置培養(yǎng)。以自然浸米釀酒為對(duì)照,跟蹤發(fā)酵過(guò)程中第4、7、14、21 天的總酸、還原糖、酒精度的變化,黃酒理化指標(biāo)分析參考GB/T 13662—2018《黃酒》[24]。感官品評(píng)邀請(qǐng)國(guó)家黃酒評(píng)酒委員進(jìn)行品評(píng)打分。

2 結(jié)果與分析

2.1 適合生物酸化浸米的乳酸菌的篩選

2.1.1 浸米漿水中乳酸菌的分離篩選

將黃酒自然浸米過(guò)程中第3～5天浸米漿水通過(guò)稀釋分離培養(yǎng)的方法涂布于GYP培養(yǎng)基上,在33 ℃恒溫培養(yǎng)72 h,挑選出透明圈較大的菌株進(jìn)行劃線分離純化,并經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性的菌株,如圖1所示,共得到65株菌株。

a-菌株透明圈；b-革蘭氏染色圖1 GYP培養(yǎng)基中的菌株透明圈及革蘭氏染色情況Fig.1 Transparent circle and gram staining of the strain in GYP medium

2.1.2 菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)

將上述65株菌接種于米飯?zhí)腔号囵B(yǎng)基中,33 ℃培養(yǎng)48 h,分別測(cè)定其OD600值和總酸,觀察其生長(zhǎng)和產(chǎn)酸情況。選取總酸>4 g/L,OD600值>0.500的菌株,共得到20株菌,這部分菌株的總酸和OD600值如圖2所示。在相同培養(yǎng)條件下,B1、C6、D3、F4、F6菌株OD600≥1.0,且總酸≥5.5 g/L,為生物酸化浸米初篩菌株。

圖2 部分菌株培養(yǎng)48 h后的OD600值和總酸Fig.2 OD600 and total acid of some strains cultured for 48 h

2.1.3 菌株產(chǎn)生物胺實(shí)驗(yàn)

將挑選出的20株菌接種于液體脫羧酶培養(yǎng)基中于33 ℃培養(yǎng)96 h,以未接種乳酸菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。菌株產(chǎn)生物胺能力越強(qiáng),培養(yǎng)基顏色越深,觀察液體脫羧酶培養(yǎng)基顏色變化,以“+”表示培養(yǎng)基顏色深淺,結(jié)果如表1所示。剔除液體脫羧酶培養(yǎng)基顏色較深的6株菌株B1、B4、E2、F6、G2、G5,剩余14株菌體培養(yǎng)液離心后使用反相HPLC上機(jī)檢測(cè)生物胺(腐胺、組胺、酪胺)含量進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn),其結(jié)果如圖3所示。不同菌株產(chǎn)生物胺能力不同,其中產(chǎn)生腐胺含量為21.30～114.20 mg/L,產(chǎn)生酪胺含量為10.46～30.81 mg/L,產(chǎn)生組胺含量為1.18～4.58 mg/L。生物胺總量在33.23～146.74 mg/L。產(chǎn)生物胺量較低菌株有A7、D3、F3。

表1 分離篩選出的菌株產(chǎn)生物胺能力對(duì)比(液體脫羧酶培養(yǎng)基)Table 1 Comparison of biogenic amine production capacity of isolated and screened strains

圖3 分離篩選出的菌株產(chǎn)生物胺能力對(duì)比Fig.3 Comparison of biogenic amine production capacity of isolated and screened strains

2.1.4 16S rDNA的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)圖2和圖3綜合分析,D3的OD600值和總酸較高,且產(chǎn)生物胺能力較低,適合成為黃酒生物酸化浸米的目標(biāo)菌株。目標(biāo)菌株經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳后得到約1 500 bp擴(kuò)增產(chǎn)物。菌種測(cè)序后經(jīng)過(guò)Blast序列比對(duì),MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果如圖4所示。菌株D3與LactobacillusplantarumNRPL B—14768親緣關(guān)系最近,可以確定D3菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

2.2 生物酸化浸米漿水的循環(huán)回用浸米

2.2.1 生物酸化浸米漿水的品質(zhì)及形態(tài)觀察

接種乳酸菌D3種子液進(jìn)行生物酸化浸米培養(yǎng)3 d,以自然浸米為對(duì)照,觀察浸米漿水的品質(zhì)和形態(tài)。自然浸米的浸米漿水氣味不宜,有異嗅味和“白花”狀物質(zhì)。而生物酸化浸米漿水氣味良好,表面無(wú)“白花”,品質(zhì)比較均一。不同浸米方式米漿水的總酸和pH測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。生物酸化浸米3 d已經(jīng)使米漿水總酸達(dá)到了8.43 g/L,而自然浸米3 d時(shí)總酸只有4.55 g/L,直到5 d才達(dá)到8.50 g/L。說(shuō)明生物酸化浸米能加快浸米進(jìn)程,可有效縮短浸米時(shí)間2 d。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

表2 不同浸米方式的米漿水pH和總酸含量對(duì)比Table 2 pH and total acid content of rice water in different ways of soaking rice

2.2.2 生物酸化浸米漿水的循環(huán)回用浸米

生物酸化浸米3 d結(jié)束后的浸米漿水經(jīng)紗布過(guò)濾靜置澄清后,按照體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%的比例替代自來(lái)水繼續(xù)用于下一次生物酸化浸米,浸米結(jié)束后測(cè)定pH、總酸、OD600值。跟蹤了9批次生物酸化浸米漿水循環(huán)回用過(guò)程,觀察其指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知,隨著生物酸化浸米漿水循環(huán)回用次數(shù)的增加,最初乳酸菌不斷富集,所分泌的乳酸等使得總酸含量升高,浸米漿水的pH降低,同時(shí)米漿水中OD600值逐漸增加,第3次循環(huán)回用時(shí)總酸、pH和OD600已基本趨于穩(wěn)定。對(duì)比自然浸米5 d的總酸為8.50 g/L,生物酸化浸米漿水回用比例為20%的總酸較低,達(dá)不到抑制雜菌的目的。而40%和50%的總酸則太高,不利于黃酒的釀造。循環(huán)3次后米漿水回用比例為30%時(shí)總酸為8.52 g/L,與自然浸米5 d的總酸基本相近,因此確定最適宜米漿水回用比例為30%。

a-pH；b-總酸；c-OD600圖5 黃酒生物酸化浸米漿水循環(huán)回用過(guò)程中pH、總酸和OD600值變化Fig.5 Changes of pH,total acid and OD600 in the water recycling process of rice soaked by biological acidification of Chinese rice wine

2.3 生物酸化浸米漿水回用釀酒實(shí)驗(yàn)

浸米是黃酒釀造的第一步,采用生物酸化浸米能夠縮短浸米時(shí)間,提高浸米漿水酸度。黃酒是最終發(fā)酵產(chǎn)品,需通過(guò)黃酒釀造實(shí)驗(yàn)探討生物酸化浸米對(duì)其影響,進(jìn)一步探討生物酸化浸米的可行性。稱取1 kg糯米分別采用生物酸化浸米3 d和自然浸米5 d,然后進(jìn)行黃酒釀造實(shí)驗(yàn),其中生物酸化浸米在釀酒投料時(shí)以20%浸米漿水來(lái)代替自來(lái)水進(jìn)行投料,分別測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中第4、7、14、21天的總酸、酒精度、還原糖的變化,結(jié)果如圖6所示。黃酒發(fā)酵過(guò)程中總酸呈現(xiàn)先快后慢上升趨勢(shì),生物酸化浸米的起始酸度高于自然浸米,但兩者最終無(wú)明顯差異,原因可能是投料時(shí)酸度增加抑制了產(chǎn)酸雜菌的生長(zhǎng)。生物酸化浸米釀酒的酒精度較高,一方面由于浸米時(shí)間縮短減少了原料的淀粉損失,另一方面浸米水中較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵。2種浸米方式對(duì)發(fā)酵過(guò)程和發(fā)酵結(jié)束后還原糖含量無(wú)明顯影響。

a-總酸；b-酒精度；c-還原糖圖6 不同浸米方式釀酒過(guò)程中的總酸、酒精度、還原糖對(duì)比Fig.6 Total acid, alcohol content and reducing sugar during fermentation process in different ways of soaking rice

對(duì)后酵結(jié)束后壓榨的黃酒進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定和感官品評(píng),結(jié)果如表3所示。對(duì)照GB/T 17946—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 紹興酒(紹興黃酒)》[25],所釀制的黃酒符合紹興黃酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中優(yōu)等品要求。生物酸化浸米釀制的黃酒總酸、總糖和非糖固形物與自然浸米釀造的黃酒無(wú)明顯差異,酒精度和氨基酸態(tài)氮高于自然浸米釀造的黃酒。酒精度提高是由于浸米時(shí)間縮短、浸米過(guò)程淀粉損失降低及米漿水中帶入有利于酵母生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所致。氨基酸態(tài)氮提高是由于米漿水回用帶入一定量的氨基酸所致,黃酒中氨基酸態(tài)氮含量適當(dāng)提高有利于酒的醇厚性。經(jīng)多名評(píng)酒委員品評(píng)認(rèn)為,生物酸化浸米所釀黃酒與自然浸米所釀黃酒的感官質(zhì)量無(wú)明顯差異,且前者要略優(yōu)于后者。同時(shí),由于生物酸化浸米使用低產(chǎn)生物胺的菌株D3,能降低黃酒生物胺含量64.3%,對(duì)黃酒釀造的安全性有著積極意義。

表3 不同浸米工藝黃酒后酵結(jié)束后指標(biāo)測(cè)定Table 3 Indexes of Chinese rice wine after the fermentation by different ways of soaking rice

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的自然浸米時(shí)間長(zhǎng),浸米漿水處理成本高昂。本研究利用GYP透明圈和革蘭氏染色從黃酒浸米漿水中分離出65株細(xì)菌,并研究其生長(zhǎng)產(chǎn)酸以及產(chǎn)生物胺能力,獲得了1株適合用于生物酸化浸米的乳酸菌D3,經(jīng)過(guò)16S rDNA序列分析鑒定該菌株為植物乳桿菌(L.plantarum)。

將其應(yīng)用于生物酸化浸米,對(duì)比自然浸米,生物酸化浸米漿水無(wú)不良?xì)馕?且縮短浸米時(shí)間2 d。將生物酸化浸米漿水靜置澄清后循環(huán)回用,隨著乳酸菌的不斷積累,浸米漿水中的總酸升高,pH降低。循環(huán)回用3次后基本保持穩(wěn)定,參照自然浸米的總酸,確定浸米漿水回用的比例為30%。

將生物酸化浸米(浸米漿水回用20%替代投料水)和自然浸米用于黃酒的釀造實(shí)驗(yàn),跟蹤發(fā)酵過(guò)程中第4、7、14、21天總酸、酒精度、還原糖的變化,發(fā)現(xiàn)生物酸化浸米釀酒的酒精度要高于自然浸米釀造的黃酒。對(duì)后酵結(jié)束后壓榨的黃酒進(jìn)行各項(xiàng)理化指標(biāo)測(cè)定和感官品評(píng),均符合GB/T 17946—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 紹興酒(紹興黃酒)》的標(biāo)準(zhǔn)。因此生物酸化浸米漿水回用于循環(huán)浸米和投料是可行的,且具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。