王仲明, 謝躍杰, 李永紅,魏華恒,邢巧,陳聰,成欣咸,王強(qiáng)*

1(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶,400067) 2(重慶第二師范學(xué)院 脂質(zhì)資源利用及兒童日化產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶,400067)

油橄欖(OleaeuropaeaL.),屬于木犀科(Oleaceae)木犀欖屬品種之一,富含各種營養(yǎng)物質(zhì),為亞熱帶常綠喬木,主要分布在地中海沿岸地區(qū)。油橄欖距今已有4 000多年的栽培歷史，20世紀(jì)中期,我國開始進(jìn)行油橄欖的引種栽培,主要種植于湖北、云南、甘肅、四川等地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國已種植油橄欖5.3萬 hm2[1],油橄欖總資源超過170余份[2]。在地中海國家,橄欖葉的“煎服”常作為民間用藥[3],研究證明油橄欖葉提取物可增加動(dòng)脈血液流速[4]，具有降血糖、抗氧化、降血壓、抗微生物等作用[5],且油橄欖葉中的抗氧化活性物質(zhì)含量比油橄欖果、莖和樹皮都高[6]。橄欖葉主要含有橄欖苦苷、多酚和黃酮等活性物質(zhì)[7]。王潔等[8]對橄欖葉中常見功效成分的作用機(jī)制進(jìn)行了總結(jié),橄欖葉中的活性物質(zhì)可抑制膽固醇的生物合成、腸道吸收，并促進(jìn)膽汁酸糞便排泄,從而降低膽固醇的水平,對高血脂的治療具有重要意義。

高血脂是由于血液中高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)含量偏低,總膽固醇(total cholesterol, TCHO)和甘油三酯(triglyceride, TG)含量偏高引起的血脂異常疾病。研究表明,高血脂會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化,從而引起糖尿病、高血壓等諸多疾病,其中動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)病的主要原因[9-10]。高血脂癥患者同時(shí)患冠心病、心肌梗死和猝死的幾率均比正常人高[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界范圍內(nèi)每年死于高血脂癥及相關(guān)疾病的總?cè)藬?shù)約為1 800萬。相關(guān)研究表明,將有更多的人死于這類心血管疾病,且心血管疾病已經(jīng)成為導(dǎo)致死亡的首要疾病[12]。臨床醫(yī)學(xué)表明,高血脂、高血壓等疾病通過藥物治療效果不甚理想,且對人體有一定的副作用，而通過天然膳食調(diào)節(jié)的效果更佳。橄欖葉提取物能天然降壓,清理血管，降低膽固醇,且沒有嚴(yán)重的毒副作用,是天然的降脂植物。因此,橄欖葉提取物降血脂的研究對高血壓、高血脂以及糖尿病并發(fā)癥的防治具有一定意義,在保健功能產(chǎn)品開發(fā)領(lǐng)域具有較好的市場價(jià)值和發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料、試劑

4～6周齡的無特定病原體(specific pathogen free, SPF)雄性昆明小鼠60只,由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供,飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)小鼠同室分籠,分裝為5籠,每籠6只,室溫控制在(23±2)℃,濕度適中。經(jīng)學(xué)院倫理委員會(huì)審查,所選擇的動(dòng)物品種、等級、數(shù)量、規(guī)格合適。實(shí)驗(yàn)中善待動(dòng)物,給予麻醉和鎮(zhèn)痛處理,實(shí)驗(yàn)后給予安樂死,死后動(dòng)物無害化處理,沒有對環(huán)境帶來危害,實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究倫理標(biāo)準(zhǔn)。

皮瓜爾橄欖葉、鄂植8號(hào)橄欖葉,重慶江源油橄欖開發(fā)有限公司基地。普通飼料：主要含雞肉、魚粉、豆粕、麩皮、玉米、面粉等；高脂飼料：含18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)脂肪、25%蛋白質(zhì)、1%膽固醇、0.2%牛膽鹽,南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場。

TG試劑盒、TCHO試劑盒、HDL-C試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)試劑盒,南京建成生物工程研究所；其余試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器和設(shè)備

LUX多功能性酶標(biāo)儀,美國Thermo Fisher Scientific公司；R1002VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長城科工貿(mào)有限公司；ICEN-24R高速冷凍離心機(jī),杭州奧盛儀器有限公司；BX43生物顯微鏡,日本奧林巴斯公司；多孔恒溫水浴鍋,鄭州長城科工有限公司；過濾裝置(漏斗與濾瓶)；粉碎機(jī),天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 灌胃物質(zhì)

取橄欖葉100 g,置于粉碎機(jī)中粉碎成粉末狀。分別在稱取15、30、45 g橄欖葉粉末于燒杯中,加入200 mL蒸餾水(粉末均勻分散于水中,不呈現(xiàn)塊狀或糊狀),置于85 ℃的水浴鍋中充分水浴50 min。取出過濾(若殘?jiān)^多,考慮抽濾)。將濾液放于燒杯中后轉(zhuǎn)移至500 mL圓底燒瓶中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),蒸發(fā)至100 mL(燒瓶中無沉淀物析出)。最終分別制得質(zhì)量濃度為150、300、450 g/L的皮瓜爾油橄欖葉(Picual olive leaves, POL)和鄂植8號(hào)油橄欖葉(E planting No.8 olive leaves, EP8OL)提取物為灌胃物質(zhì)。

1.3.2 誘導(dǎo)高脂小鼠模型

小鼠隨機(jī)分為普通組和高脂飼料組,飼喂普通飼料一周以適應(yīng)環(huán)境。普通組以普通飼料為食,高脂飼料組參考文獻(xiàn)[13-14]對小鼠高血脂體誘導(dǎo)的研究為模型,借鑒文獻(xiàn)[15-16]對的高脂飼料成分進(jìn)行配比,喂食28 d得到實(shí)驗(yàn)所需的高脂體小鼠模型。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組與灌胃

以健康小鼠為空白組(普通飼料+自來水),模型小鼠分為對照組(高脂飼料+蒸餾水)、橄欖葉提取物低劑量組(高脂飼料+150 g/L提取物)、橄欖葉提取物中劑量組(高脂飼料+300 g/L提取物)、橄欖葉提取物高劑量組(高脂飼料+450 g/L提取物)；每日灌胃量為0.2 mL,灌胃周期為4周,灌胃期間均用普通飼料投食,每周對小鼠進(jìn)行1次稱重并記錄。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)小鼠取材

灌胃結(jié)束后,將小鼠絕食(不斷水)24 h,并進(jìn)行解剖前稱重,對小鼠經(jīng)摘眼球取血后,將小鼠處死解剖,將全部解剖完的小鼠尸體進(jìn)行集中無害化處理[17]。血液用2 mL離心管收集,在1 000 r/min條件下離心10 min,分離血清,并立即放于4 ℃冰箱冷凍保存,用于后續(xù)測定血清中TCHO、TG、HDL-C、LDL-C含量；取出小鼠肝臟,剪下一小部分裝入含有體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液的2 mL離心管中,于4 ℃冰箱冷藏保存,用于后續(xù)制作蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色切片。

1.3.5 血清生化指標(biāo)測定

將小鼠已離心好的血清全部解凍,TCHO、TG、HDL-C、LDL-C按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

96孔板注射方法：取一個(gè)潔凈的96孔板,將其標(biāo)注為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔,用10 μL移液槍吸取蒸餾水注入96孔板的前3個(gè)孔作為空白孔,每個(gè)孔2.5 μL；在空白孔后3個(gè)孔每孔注入2.5 μL校準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)孔；其余為樣本孔,樣本孔為實(shí)驗(yàn)組的5組樣品。滴加順序依次為空白組、低濃度組(150 g/L%)、中濃度組(300 g/L)、高濃度組(450 g/L)和對照組,每組5個(gè)樣品,每個(gè)樣品滴加3個(gè)孔,做平行試驗(yàn),每個(gè)孔注入樣品2.5 μL。

1.3.6 肝組織病理學(xué)觀察

取出肝臟組織,按照固定→脫水→浸蠟→包埋→切片→脫蠟→復(fù)水→染色→烘干→封片→觀察的步驟進(jìn)行制片,于40×10倍的電子顯微鏡下,觀察小鼠肝臟切片的組織細(xì)胞(主要觀察主動(dòng)脈周圍),對小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)進(jìn)行分析。剩余的組織存于自封袋,于-80 ℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部來自于3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Origin 軟件作圖。采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖葉提取物對小鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量是一項(xiàng)可以衡量人和動(dòng)物肥胖的指標(biāo),而肥胖是影響心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[18],是誘發(fā)心血管疾病的主要原因[19],肥胖與甘油三酯水平增加、HDL-C水平減少密切相關(guān)[20]。因此,在控制體質(zhì)量的同時(shí)也能控制血清中膽固醇的水平,降低血脂水平,減少心血管疾病的發(fā)生。研究表明,油橄欖葉直接喂食反芻動(dòng)物,可使瘤胃細(xì)菌合成蛋白質(zhì)量增加[21]。

由圖1可知,經(jīng)灌胃處理后,與高脂對照組相比,2組小鼠的體質(zhì)量增長速度明顯降低,隨著提取物濃度的增加效果越明顯。經(jīng)EP8OL灌胃的小鼠在1～3周的體質(zhì)量無明顯差異,第3周體質(zhì)量呈現(xiàn)顯著下降趨勢；經(jīng)POL灌胃的小鼠在灌胃期內(nèi)體質(zhì)量顯著低于對照組,從第2周開始實(shí)驗(yàn)組的體質(zhì)量增長趨于平緩。

圖1 鄂植8號(hào)橄欖葉(a)、皮瓜爾橄欖葉(b)提取物對小鼠體質(zhì)量變化的影響Fig.1 Effect of EP8OL (a) and POL (b) on body mass of mice

實(shí)驗(yàn)表明,EP8OL和POL提取物均對高脂小鼠的體質(zhì)量增長具有抑制作用,各劑量組的抑制效果一致,其中EP8OL對降低小鼠體質(zhì)量的作用效果明顯。

2.2 橄欖葉提取物對小鼠血脂指標(biāo)的影響

小鼠經(jīng)飼喂高脂飼料后,血清中總膽固醇含量上升顯著,甘油三酯、LDL-C含量上升,HDL-C含量下降。說明飼喂高脂飼料后,小鼠脂類代謝失調(diào),血清中的膽固醇水平升高,產(chǎn)生高脂血癥。經(jīng)橄欖葉提取物灌胃后,小鼠血脂顯著降低,肝臟脂肪樣變減少,組織損傷減低。POUDYAL等[22]發(fā)現(xiàn)橄欖葉提取物降糖、降血脂作用與其較強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān),其機(jī)制可能與其改善肝臟氧化應(yīng)激水平有關(guān)[23]。

2.2.1 血清中總膽固醇含量

人體膽固醇約2/3由肝臟進(jìn)行內(nèi)源性合成。在肝細(xì)胞中,通過HMG-CoA還原酶途徑,在細(xì)胞內(nèi)形成膽固醇。正常情況下,細(xì)胞內(nèi)過多的膽固醇會(huì)外流[24]。若外流機(jī)制受損,膽固醇就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積,導(dǎo)致人體內(nèi)的脂類代謝失調(diào),血清中的膽固醇水平就會(huì)升高,從而產(chǎn)生高脂血癥。

根據(jù)圖2可知,空白組小鼠中總膽固醇含量最低。與對照組相比,低劑量組降低膽固醇含量效果最佳,效果與濃度呈負(fù)相關(guān),說明提取物的濃度過高并不利于降低膽固醇。2種灌胃物質(zhì)在抑制小鼠體內(nèi)的總膽固醇水平的作用效果相似。

圖2 橄欖葉提取物灌胃后小鼠總膽固醇水平Fig.2 Total cholesterol level in mice after gavage of olive leaf extract

實(shí)驗(yàn)表明,小鼠體內(nèi)總膽固醇含量：低濃度組<中濃度組<高濃度組<對照組,說明降低高脂小鼠膽固醇含量效果最佳的是150 g/L橄欖葉提取物,其中POL降低小鼠體內(nèi)膽固醇水平更穩(wěn)定,EP8OL提取物灌胃后小鼠血清膽固醇含量是POL提取物的數(shù)倍,說明體內(nèi)膽固醇的蓄積還可能與小鼠自身體質(zhì)、消化吸收有關(guān)。

2.2.2 血清中甘油三酯含量

“甘油三酯”又稱脂肪,是由食物脂肪與肝臟合成的,由長鏈脂肪酸和甘油形成,是血脂檢查中比較重要的一項(xiàng)指標(biāo)。輕度甘油三酯增高,可能是糖類食物攝入過多、吸煙、肥胖等因素引起,重度的高甘油三酯,多與糖尿病、肝病、慢性腎炎等有關(guān)。研究表明,高甘油三酯可引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[25],增加胞內(nèi)Ca+濃度,導(dǎo)致高甘油三酯血癥性胰腺炎[26]。

由圖3可知,各濃度組的甘油三酯含量均低于對照組,說明油橄欖葉提取物能有效降低小鼠的甘油三酯含量,中濃度組的降低效果最佳,但各濃度組降低效果無顯著差異,小鼠體內(nèi)甘油三酯含量：中濃度組<低濃度組<高濃度組。與正常小鼠(空白組)相比,EP8OL高劑量和中劑量組小鼠甘油三酯含量更低,而POL劑量組小鼠的甘油三酯含量均高于空白組,說明同一劑量濃度下,EP8OL降低小鼠體內(nèi)甘油三酯含量效果更好。

圖3 橄欖葉提取物灌胃后小鼠甘油三酯含量Fig.3 Average contents of triglyceride in mice after gavage of olive leaf extract

2種提取物均能降低高脂小鼠甘油三酯含量,隨灌胃物質(zhì)濃度的升高,甘油三酯含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,但POL提取物灌胃組的小鼠體內(nèi)甘油三酯含量波動(dòng)更大,而EP8OL組小鼠體內(nèi)的甘油三酯含量較平穩(wěn)。

2.2.3 血清中HDL-C含量

高密度脂蛋白膽固醇可通俗地理解為“好”膽固醇,血漿脂蛋白中,HDL具有抗炎性反應(yīng)作用[27],可減少主動(dòng)脈壁VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)[28],減少代謝性內(nèi)毒素血癥[29]?？煽箘?dòng)脈粥樣硬化,調(diào)節(jié)血脂水平,減少患冠狀動(dòng)脈心臟病的危險(xiǎn)。

根據(jù)圖4可知,HDL-C含量空白組高于對照組和實(shí)驗(yàn)組,說明高脂飲食能影響小鼠體內(nèi)的高密度蛋白膽固醇水平。2組小鼠中空白組與對照組的HDL-C含量差值為0.1～0.11 mmol/L；3個(gè)濃度組與對照組間對比可得,一定濃度的橄欖葉提取物有利于提升HDL-C的含量,但提升并不顯著,且在同一濃度下2種灌胃物質(zhì)對小鼠體內(nèi)HDL-C含量的影響波動(dòng)范圍均在0.2 mmol/L。

圖4 橄欖葉提取物灌胃后小鼠HDL-C含量Fig.4 HDL-C content in mice after gavage of olive leaf extract

2類物質(zhì)在穩(wěn)定HDL-C含量的最佳濃度不同,且HDL-C水平各組間比較平穩(wěn)。因此,EP8OL和POL對于小鼠體內(nèi)HDL-C的血脂水平作用效果一致。

2.2.4 血清中LDL-C含量

人或動(dòng)物體內(nèi)的LDL-C主要負(fù)責(zé)把膽固醇從肝臟運(yùn)送到各個(gè)組織,再由高密度脂蛋白將各處的膽固醇送回肝臟代謝[30]。但當(dāng)?shù)兔芏戎鞍走^量時(shí),由它攜帶的膽固醇便積存在動(dòng)脈壁上,容易引起動(dòng)脈硬化,影響血脂水平,引發(fā)心血管疾病[31]。

根據(jù)圖5,鄂植8號(hào)組的正常小鼠LDL-C含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組、略低于對照組,實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組,說明EP8OL提取物能顯著降低小鼠體內(nèi)的LDL-C含量,其中油橄欖提取物濃度對小鼠體內(nèi)LDL-C水平影響不大,中濃度組小鼠LDL-C含量最低；POL實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組,說明POL能有效降低高脂小鼠的LDL-C含量,其中高濃度組小鼠LDL-C含量最低。實(shí)驗(yàn)表明,橄欖葉提取物能有效降低小鼠體內(nèi)LDL-C水平,EP8OL作用效果更佳,能將小鼠體內(nèi)LDL-C水平降低至正常小鼠以下。因此,降脂效果與小鼠個(gè)體體質(zhì)、橄欖葉品種、提取物濃度有關(guān)。

圖5 橄欖葉提取物灌胃后小鼠LDL-C含量Fig.5 LDL-C content in mice after gavage of olive leaf extract

2.2.5 橄欖葉提取物對小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

肝臟是脂肪攝取、氧化、脂肪酸代謝、膽固醇、磷脂和脂蛋白的合成和分泌的重要器官,正常狀態(tài)下,脂類代謝在肝臟中保持著動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)攝入脂質(zhì)過多時(shí),會(huì)引起脂代謝紊亂,大量脂肪從脂庫中出來,大部分進(jìn)入肝細(xì)胞。肝內(nèi)脂肪的增加超過了肝細(xì)胞將其氧化利用和合成脂蛋白運(yùn)輸出去的能力,則使肝細(xì)胞脂肪沉積及肝細(xì)胞變性,形成脂肪肝[32-33]。DAY[34]提出的“二次打擊”學(xué)說以脂質(zhì)代謝異常、脂質(zhì)過氧化等被廣泛接受。研究表明,油橄欖葉除具有抗氧化、抗菌、降脂作用外,對鉛中毒的小鼠各項(xiàng)臟器指標(biāo)具有改善作用[35]。因此,橄欖葉提取物對小鼠肝組織的病變也具有一定的改善、調(diào)節(jié)作用。

由圖6可知,兩大組的空白組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊、緊密,形態(tài)正常,細(xì)胞以中心經(jīng)脈為中心呈散發(fā)狀分布。對照組肝細(xì)胞排列雜亂無序、松散,中心經(jīng)脈周圍細(xì)胞排列雜亂,細(xì)胞界限不明顯,細(xì)胞間隙較大,肝損傷嚴(yán)重。進(jìn)行橄欖葉提取物營養(yǎng)干預(yù)后,低濃度組肝細(xì)胞排列較為紊亂,比較松弛,細(xì)胞核大小不一,細(xì)胞界限較為明顯,低濃度組肝細(xì)胞形態(tài)總體優(yōu)于對照組。300 g/L中濃度組肝細(xì)胞排列有序,比較緊密,細(xì)胞間隙比較明顯,中心靜脈周圍的細(xì)胞呈較有規(guī)律地排列,細(xì)胞呈有規(guī)律的散發(fā)狀分布,肝細(xì)胞總體形態(tài)有所緩解。高濃度組肝細(xì)胞形態(tài)與空白組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)更相近,排列相對規(guī)整。實(shí)驗(yàn)表明EP8OL可以有效緩解小鼠肝細(xì)胞損傷。2組空白組小鼠的肝臟均未受到損傷，經(jīng)灌胃后,2組小鼠的肝病變程度均隨著提取物濃度的增強(qiáng)而變小,說明了較高濃度的橄欖葉提取物對小鼠肝損傷病變有良好的治療作用,也對高血脂小鼠的肝臟病變有明顯的抑制和調(diào)節(jié)作用[36-37]。

1-空白組；2-對照組；3-低濃度組；4-中濃度組；5-高濃度組圖6 鄂植8號(hào)橄欖葉(a)、皮瓜爾橄欖葉(b)提取物對小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響Fig.6 Effect of EP8OL (a) and POL (b) extracts on liver histopathology in mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中2種橄欖葉提取物對模型小鼠體質(zhì)量控制具有較好的效果,EP8OL提取物降低小鼠體質(zhì)量的效果明顯,POL提取物也能有效地抑制小鼠體質(zhì)量的增長速率。

2種橄欖葉提取物均能降低模型小鼠總膽固醇、甘油三酯、LDL-C的水平,并能提高小鼠HLD-C的含量,使實(shí)驗(yàn)小鼠血清指標(biāo)趨于正常水平,起到調(diào)節(jié)血脂的作用,其降脂效果相似,總體效果趨于一致。但2種橄欖葉提取物降低總膽固醇、甘油三酯、LDL-C水平,升高HDL-C水平的最佳濃度不同。2種橄欖葉提取物能降低高脂飲食對實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織的損傷,隨提取物濃度的增加,作用效果越顯著。因此,橄欖葉能抑制高脂模型小鼠的肝臟病變,起到調(diào)節(jié)肝損傷的作用。