許白雪，陳谷，劉秤利，周健

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

藍(lán)藻是地球上最主要的光合生物之一，它們可以利用光作為能源，吸收二氧化碳并產(chǎn)生氧氣，對(duì)當(dāng)今地球的生存環(huán)境起著至關(guān)重要的作用[1]。雖然藍(lán)藻主要是在光自養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但有些種類在有機(jī)碳源存在的情況下也能進(jìn)行光混養(yǎng)或異養(yǎng)。集胞藻PCC6803（Synechocystissp.PCC6803）作為一種模式藍(lán)藻，可以在光混養(yǎng)和異養(yǎng)條件下，通過(guò)糖酵解、不完全的TCA循環(huán)以及氧化磷酸戊糖（OPP）途徑來(lái)代謝葡萄糖，生成ATP、NADPH和碳骨架，同時(shí)葡萄糖代謝水平和呼吸作用增強(qiáng)[2,3]。

在過(guò)去的幾十年里，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)集胞藻在光混養(yǎng)條件下生長(zhǎng)至關(guān)重要的基因。一些是起調(diào)控作用的基因，例如：三個(gè)組氨酸激酶：Hik31（sll0790）、Hik8（sll0750）和Hik33（sll0698），它們?cè)谄咸烟谴x中扮演主要的角色。Δhik31突變體會(huì)失去葡糖激酶活性，變得對(duì)葡萄糖更加敏感[4]，hik8的缺失將會(huì)阻止基因gap1（編碼GAPDH）的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞不能在葡萄糖存在時(shí)生長(zhǎng)[5]。相比之下，hik33敲除突變體的在光自養(yǎng)條件下生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而在加入葡萄糖之后這種抑制出現(xiàn)了緩解，主要是因?yàn)樵诖藯l件下突變體中OPP途徑中的酶的表達(dá)明顯上調(diào)，而在野生型中并沒(méi)有這種現(xiàn)象[6]。編碼假想調(diào)控蛋白的基因pmgA（sll1968）以及水通道蛋白AqpZ（slr2057），都受到基因sll1961的正向調(diào)控，它們?cè)谄咸烟谴x中至關(guān)重要，它們的缺失突變體會(huì)變得對(duì)葡萄糖更加敏感[7]。pmgA（sll1968）的缺失破壞了OPP途徑和卡爾文循環(huán)之間的碳流平衡，阻止了突變體在光異養(yǎng)條件下的持續(xù)生長(zhǎng)[3]。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 CyabrB2（sll0822）對(duì)當(dāng)細(xì)胞從自養(yǎng)轉(zhuǎn)移至光異養(yǎng)條件下時(shí)細(xì)胞代謝的激活至關(guān)重要，sll0822的敲除突變體可能使碳代謝失調(diào)，從而喪失生存能力[8]。SigE是RNA聚合酶中的一種sigma因子，其突變會(huì)使OPP通路的關(guān)鍵酶出現(xiàn)下調(diào)，同時(shí)葡萄糖攝取率下降[9]。此外，一些特定的蛋白質(zhì)也參與了集胞藻對(duì)葡萄糖混養(yǎng)的適應(yīng)，它們的突變體均表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖敏感的表型。Sml0013是NAD(P)H脫氫酶（NDH）亞基，它的突變體使通過(guò)呼吸或光合電子流能力下降，從而變得對(duì)葡萄糖更加敏感[10]。sll1028（編碼二氧化碳濃縮機(jī)制蛋白CcmK2）、slr1916（編碼酯酶）、slr1860（icfG）和sml0005（編碼PSII的跨膜成分）的突變體也顯示出了葡萄糖敏感性[11]。最近的一項(xiàng)研究表明，非編碼RNA Ncr0700通過(guò)調(diào)節(jié)糖原積累參與葡萄糖的適應(yīng)，并在PmgA下游發(fā)揮作用[12]。

代謝組學(xué)技術(shù)可以鑒別出細(xì)胞內(nèi)大量的小分子及其豐度的差異，因此被廣泛用于分析微生物面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)出現(xiàn)的變化。非靶向氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）代謝組學(xué)相對(duì)于靶向液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）而言，可以檢測(cè)到更多的代謝物，其中包括一些穩(wěn)定的小分子，如氨基酸，糖類以及有機(jī)酸等[1]。S2P蛋白酶最早在人體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，在人體內(nèi)甾醇和脂肪酸的合成中起調(diào)節(jié)作用[13]。集胞藻 PCC6803中共存在4個(gè)S2P蛋白酶，分別為Slr0862、Slr0643、Sll0528和Slr1821。我們以前的研究已經(jīng)表明Sll0528參與各種環(huán)境脅迫，包括鹽、寒冷、高滲和銨鹽等，Δsll0528突變體在這些環(huán)境中比野生型更敏感[14,15]。Slr0862參與調(diào)控著熱脅迫和氧化脅迫[16]，Slr1821在熱脅迫適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[17]，Slr0643在適應(yīng)酸脅迫中起關(guān)鍵作用[18]。本文通過(guò)GC-MS技術(shù)對(duì)葡萄糖混養(yǎng)下的野生型和Δslr0643突變體中的代謝物進(jìn)行研究，結(jié)合差異代謝物及代謝通路分析，從代謝組學(xué)的角度上揭示了 Slr0643在集胞藻適應(yīng)葡萄糖混養(yǎng)中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

主要材料：甲醇（CNW）、氯仿（Adamas）、吡啶（Adamas）、甲氧銨鹽（TCI）、L-2-氯苯丙氨酸，上海恒柏生物科技；BSTFA（REGIS）、飽和脂肪酸甲酯（REGIS）、ddH2O（純水儀）、葡萄糖，北京普博欣生物；BG11培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室自配；集胞藻PCC6803野生型，購(gòu)自ATCC菌種庫(kù)；集胞藻PCC6803Δslr0643突變體，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

主要儀器：氣相色譜（Agilent，7890B）、質(zhì)譜儀（LECO，PEGASUS HT）、色譜柱（Agilent，DB-5MS）、離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，Heraeus Fresco17）、超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific，F(xiàn)orma 900 series）、分析天平（Sartorius，BSA124S-CW）、研磨儀（JXFSTPRP-24），上海凈信科技有限公司；純水儀（Merck Millipore，明澈 D24 UV）、超聲儀（YM-080S），深圳市方奧微電子有限公司；烘箱（DHG-9023A），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；真空干燥儀（LNG-T98），太倉(cāng)市華美生化儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2300Ⅱ），上海天美科學(xué)儀器有限公司；葡萄糖分析儀（SBA-40C），北京金洋萬(wàn)達(dá)科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

所有菌株培養(yǎng)于20 mM HEPES-NaOH（pH 7.5）的 BG-11 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為 28 ℃，30 μE/(m2·s)，120 r/min。葡萄糖混養(yǎng)需要在BG11培養(yǎng)基中加入2.5 mM葡萄糖，所有溶液和培養(yǎng)基均進(jìn)行高溫高壓滅菌。

1.2.2 生理參數(shù)的測(cè)定方法

1.2.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在需要測(cè)定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)藻液進(jìn)行取樣，將紫外分光光度計(jì)設(shè)置為單點(diǎn)測(cè)量模式，用培養(yǎng)基調(diào)零之后，測(cè)其730 nm下的吸光度，每組樣品做三個(gè)平行，最后根據(jù)時(shí)間與吸光度值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2.2 培養(yǎng)基上清中葡萄糖含量的測(cè)定

向BG11培養(yǎng)基中加入2.5 mM葡萄糖，然后放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行混養(yǎng)培養(yǎng)，每隔兩小時(shí)進(jìn)行一次取樣，每組樣品設(shè)置三個(gè)平行，在離心機(jī)中經(jīng) 10000 r/min離心2 min后，吸取上清至2 mL離心管中，用葡萄糖分析儀進(jìn)行葡萄糖含量的測(cè)定，具體步驟為：開(kāi)機(jī)之后，先吸取20 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～1 g/L）進(jìn)行定標(biāo)，反復(fù)操作至儀器顯示定標(biāo)成功，再依次打入待測(cè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)完需清洗儀器再進(jìn)行下一次的測(cè)定。

1.2.3 樣本制備及代謝物提取

當(dāng)野生藻株和Δslr0643藻株在光自養(yǎng)條件下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)（OD=0.8），向培養(yǎng)基中加入2.5 mM葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)0 h、4 h、10 h、16 h、24 h后，收集藻泥（0 h樣品在加入葡萄糖前收集），液氮速凍存于-80 ℃保存，每組四個(gè)平行。

藻泥樣本中加入5000 μL預(yù)冷提取液（甲醇：氯仿=3:1，V/V），再加入5 μL 2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s；加入瓷珠，35 Hz研磨儀處理4 min，超聲5 min（冰水?。?；樣品4 ℃離心，10000 r/min離心10 min；取400 μL上清于1.5 mL離心管中，每個(gè)樣本各取60 μL混合成QC樣本；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入40 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min；向每個(gè)樣品中加入60 μL BSTFA（含有1% TMCS，V/V），將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL FAMEs（溶于氯仿）；隨機(jī)順序上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 代謝物檢測(cè)

Agilent 7890氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），GC-TOF-MS具體分析條件如表1所示。

表1 GC-MS儀器參數(shù)Table 1 Instrument parameters of GC-MS

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用ChromaTOF軟件（V 4.3x，LECO）對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等預(yù)處理。對(duì)物質(zhì)定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)，包括質(zhì)譜匹配及保留時(shí)間指數(shù)匹配。最后，將 QC樣本中檢出率 50%以下或RSD＞30%的峰去除。利用軟件SIMCA-P 14.0及在線網(wǎng) 絡(luò) 軟 件 Metabo Analyst 4.0（http://www.metaboanalyst.ca/Metabo Analyst）對(duì)數(shù)據(jù)歸一化和中心標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行熱圖和偏最小二乘判別分析（partical least-sequares dis-criminant analysis，PLS-DA）分析，根據(jù)變量對(duì)分組貢獻(xiàn)值（variableimportance in the projection，VIP）大于1和變化顯著性p＜0.05對(duì)差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選，然后利用Metabo Analyst 4.0進(jìn)行代謝通路的分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖混養(yǎng)條件下的生理表征

圖1 葡萄糖混養(yǎng)下的生理表征Fig.1 Physiological characteristics in glucose mixotrophic acclimation

為了探究slr0643基因在混養(yǎng)條件下的表型變化，將基因slr0643的敲除突變體（Δslr0643）藻株和野生型（WT）藻株分別在自養(yǎng)和2.5 mM葡萄糖混養(yǎng)的條件下培養(yǎng)來(lái)測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1a。自養(yǎng)條件下，Δslr0643藻株的生長(zhǎng)速率和WT藻株無(wú)顯著差異。葡萄糖混養(yǎng)時(shí)，WT藻株因?yàn)槲樟祟~外的有機(jī)碳源而生長(zhǎng)速率明顯快于自養(yǎng)條件，在混養(yǎng)第4 d時(shí)，其OD730增長(zhǎng)到了到了0.91。Δslr0643藻株的生長(zhǎng)受到了混養(yǎng)的抑制，其混養(yǎng)第4 d時(shí)的OD730僅為0.43，僅為野生型藻株的47.25%。圖1b檢測(cè)了混養(yǎng)后24 h內(nèi)，兩種藻株培養(yǎng)液上清中葡萄糖含量的變化。結(jié)果表明，野生型藻株培養(yǎng)液內(nèi)葡萄糖的消耗速率顯著高于Δslr0643藻株，且在混養(yǎng)22 h后已將培養(yǎng)液中葡萄糖完全消耗，而Δslr0643藻株混養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液中仍然剩余0.18 mM葡萄糖未被消耗。上述結(jié)果表明，在自養(yǎng)條件下，slr0643的缺失并不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，而在葡萄糖混養(yǎng)時(shí)，它的缺失會(huì)顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、造成細(xì)胞無(wú)法正常利用葡萄糖。前期研究表明，編碼假想調(diào)控蛋白的基因sll1968以及編碼水通道蛋白AqpZ的基因slr2057在集胞藻PCC6803葡萄糖代謝中至關(guān)重要，它們的缺失突變體也會(huì)變得對(duì)葡萄糖更加敏感，且它們通過(guò)參與糖酵解、戊糖磷酸途徑等代謝途徑來(lái)影響細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用[7]?；诒狙芯可韺?shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們推測(cè) Slr0643蛋白可能參與了集胞藻 PCC6803葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)的調(diào)控。然而，Slr0643調(diào)控集胞藻PCC6803葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)的代謝機(jī)制目前尚不明確，需利用代謝組學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.2 代謝組學(xué)差異分析

2.2.1 整體差異代謝物分析

圖2 整體差異代謝物的PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA scores plot of global differential metabolites

采用熱圖以及PLS-DA模型對(duì)葡萄糖混養(yǎng)不同時(shí)間后野生型藻株（W0:0 h，W4:4 h，W10:10 h，W16:16 h，W24:24 h）及Δslr0643藻株（M0:0 h，M4:4 h，M10:10 h，M16:16 h，M24:24 h）整體代謝物的差異進(jìn)行了直觀比較。圖3為整體代謝物及樣品的雙向聚類，從圖中我們可以看到，同一組樣本的四個(gè)平行之間代謝物上下調(diào)一致，表明了樣本之間的平行性及穩(wěn)定性良好。圖2為PLS-DA得分圖，同一組樣本的四個(gè)平行聚集在一起，不同組樣本分開(kāi)，表明此模型可以很好的幫助我們了解組間差異。圖中可以看到，野生型藻株在不同混養(yǎng)時(shí)間下的分離比Δslr0643藻株更加明顯，表明在混養(yǎng)條件下，野生型藻株比Δslr0643藻株代謝更加活躍，代謝物質(zhì)差異更加明顯，這個(gè)結(jié)果與生理實(shí)驗(yàn)中野生型藻株的生長(zhǎng)和葡萄糖利用速率比Δslr0643藻株更快的結(jié)果一致。另外，在16 h和24 h時(shí)，野生型和突變體出現(xiàn)重疊，表明此時(shí)兩者的差異相對(duì)于之前減小。

圖3 整體差異代謝物的熱圖Fig.3 The heat map of global differential metabolite

2.2.2 野生型與Δslr0643突變體間差異代謝物的鑒定

表2 野生型藻株不同混養(yǎng)時(shí)間代謝標(biāo)志物的變化Table 2 Fold changes of identified biomarkers in WT with different mixed culture times

為了進(jìn)一步明確葡萄糖混養(yǎng)過(guò)程中，Δslr0643藻株和野生型藻株在代謝產(chǎn)物方面的差異，我們分別對(duì)不同混養(yǎng)時(shí)間野生型藻株和Δslr0643藻株中的差異代謝物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了比較，得到了兩種藻株差異代謝物動(dòng)態(tài)變化的PLS-DA荷載圖（圖4a，4b），結(jié)合VIP＞1及p＜0.05共同篩選來(lái)尋找貢獻(xiàn)大的代謝物。表2和表3分別列出了野生型藻株和Δslr0643藻株在不同混養(yǎng)階段的差異標(biāo)志代謝物以及它們相對(duì)于自養(yǎng)時(shí)的變化量。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間下差異代謝物的PLS-DA荷載圖Fig.4 PLS-DA loadings plots of differential metabolites with different culture times

表3 Δslr0643藻株間不同時(shí)間代謝標(biāo)志物的變化Table 3 Fold changes of identified biomarkers in Δslr0643 with different mixed culture times

從表中可以看出，這些差異標(biāo)志物主要為糖類，氨基酸，有機(jī)酸，脂肪酸等。代謝標(biāo)志物大部分相同，但表達(dá)量卻差異很大。其中，野生型藻株中有關(guān)糖代謝的標(biāo)志物如蔗糖，琥珀酸，蘋果酸，乳酸，3-羥基丙酸，核糖醇等在葡萄糖加入后均大幅上升，表明其混養(yǎng)時(shí)利用葡萄糖的速度加快，而Δslr0643藻株突變體中糖代謝標(biāo)志物的數(shù)量下降，其中，蔗糖及3-羥基丙酸的表達(dá)量均低于野生型藻株，唯一參與三羧酸循環(huán)的標(biāo)志物琥珀酸表達(dá)量在加入葡萄糖后始終呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)。研究顯示，高產(chǎn)3-羥基丙酸的集胞藻菌株相對(duì)于野生型藻株，其中心碳代謝的水平會(huì)明顯提高[19]，因此，結(jié)合我們的數(shù)據(jù)可以推測(cè)，野生型藻株混養(yǎng)時(shí)的中心碳代謝途徑得到加強(qiáng)，使得細(xì)胞生長(zhǎng)加快，而slr0643的缺失，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的效率下降，從而利用葡萄糖的速度下降。從表2和表3中還可以發(fā)現(xiàn)，混養(yǎng)24 h后，野生型藻株中蔗糖的含量低于Δslr0643藻株。事實(shí)上，根據(jù)上清中葡萄糖含量的變化曲線（圖1b）可以發(fā)現(xiàn)，混養(yǎng)24 h后，野生型藻株培養(yǎng)基中葡萄糖已經(jīng)消耗完畢，而Δslr0643藻株培養(yǎng)基中葡萄糖還沒(méi)有被完全消耗，故此時(shí)Δslr0643藻株轉(zhuǎn)化生成蔗糖的量高于野生型藻株。另外，從表2和表3中發(fā)現(xiàn)，野生型藻株中氨基酸的表含量高于Δslr0643藻株。當(dāng)微藻處于缺氮和缺碳環(huán)境時(shí)，氨基酸的含量會(huì)減少，故slr0643的缺失似乎影響了細(xì)胞對(duì)碳、氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而導(dǎo)致了藻株生長(zhǎng)速率變慢。棕櫚酸的含量在兩種藻株中沒(méi)有明顯差別，且在混養(yǎng)過(guò)程中變化不大。固醇類物質(zhì) 3β，5α，6β-三羥基膽甾烷只在Δslr0643藻株標(biāo)志物中出現(xiàn)，在混養(yǎng)后期表達(dá)量均未下降，故可推測(cè)slr0643的突變影響了部分脂質(zhì)的合成。

2.2.3 差異代謝物代謝通路分析

圖5 混養(yǎng)過(guò)程中Δslr0643藻株相對(duì)于野生型藻株代謝標(biāo)志物的通路富集分析Fig.5 Pathway enrichment analysis of biomarkers in Δslr0643 compared to WT with different mixed culture times

為了進(jìn)一步了解差異代謝物所處的代謝通路，按照VIP＞1及p＜0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)比各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下Δslr0643藻株相對(duì)于野生型藻株的變化情況，篩選出差異標(biāo)志物，然后將這些差異標(biāo)志物輸入Metabo Analyst 4.0中的代謝通路富集分析模塊進(jìn)行代謝物的通路分析[20]，結(jié)果如圖5所示。這些差異標(biāo)志物主要涉及到8條代謝途徑。其中，三羧酸循環(huán)，丙酮酸代謝等糖代謝途徑以及谷氨酸，纈氨酸等氨基酸代謝途徑的顯著富集，Δslr0643藻株和野生型藻株的代謝在這些通路上出現(xiàn)了明顯的差異，結(jié)合之前對(duì)代謝標(biāo)志物的分析可以看出，Δslr0643藻株無(wú)法正常利用葡萄糖，從而影響了糖代謝，進(jìn)而導(dǎo)致了氮源吸收的減少、氨基酸合成變慢。煙酰胺是NAD和NADH的主要成分，而NAD和NADH作為遞氫的輔酶，在細(xì)胞的各種代謝途徑中均起著重要的作用，因此，煙酰胺代謝的差異可能是導(dǎo)致糖代謝差異的重要原因之一。

磷酸肌醇是重要的信號(hào)分子，與植物體的抗脅迫過(guò)程密切相關(guān)。有研究指出，苜蓿的單磷酸肌醇合成酶（MIPS）轉(zhuǎn)基因株對(duì)鹽、冷等非生物脅迫的適應(yīng)性增加[21]，擬南芥中MIPS轉(zhuǎn)基因株對(duì)鹽的耐受程度同樣提高了[22]。因此，本研究中磷酸肌醇代謝通路的差異可能導(dǎo)致了野生型藻株和Δslr0643藻株適應(yīng)葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)能力的差異。值得注意的是，丁酸甲酯代謝通路差異較為明顯，丁酸甲酯可以合成乙酰輔酶A，而后者是生物體內(nèi)各個(gè)能量代謝必不可少的物質(zhì)。此前一些研究指出，參與集胞藻葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)的蛋白有Slr0280（一種周質(zhì)蛋白）、Sml0013（NAD(P)H脫氫酶亞基）、CcmK2（二氧化碳濃縮機(jī)制蛋白，由sll1028編碼）以及非編碼RNA Ncr0700等，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解、三羧酸循環(huán)、糖原分解代謝、戊糖磷酸通路和卡爾文循環(huán)等途徑中的代謝物或者酶的活性，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的適應(yīng)[2,10,12]，它們可能與Slr0643調(diào)控集胞藻葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)機(jī)制存在著密切的聯(lián)系。綜上可以看出，Slr0643的缺失導(dǎo)致了集胞藻細(xì)胞內(nèi)葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)混養(yǎng)時(shí)的糖代謝、氨基酸代謝、磷酸肌醇代謝和乙酸甲酯代謝等途徑的代謝物出現(xiàn)較大差異，由此推測(cè)，Slr0643通過(guò)直接或間接地參與這些代謝途徑來(lái)調(diào)節(jié)集胞藻葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)。另外，之前通過(guò)對(duì)Slr0643在酸脅迫中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究分析，發(fā)現(xiàn) Slr0643在酸脅迫中起著重要的作用，并且可能是通過(guò) Slr0643/Sll0857/SigH調(diào)控機(jī)制進(jìn)行調(diào)控[18]，這個(gè)結(jié)果為我們進(jìn)一步探索Slr0643在混養(yǎng)脅迫中的具體調(diào)控機(jī)制提供了思路。

3 結(jié)論

本文采用集胞藻PCC6803野生型藻株和Slr0643敲除突變體（Δslr0643）藻株，通過(guò)生理實(shí)驗(yàn)和基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)的植物代謝組學(xué)分析，對(duì)Slr0643蛋白調(diào)控集胞藻PCC6803葡萄糖混養(yǎng)適應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行研究。生理結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然Δslr0643藻株在自養(yǎng)條件下與野生型無(wú)明顯差異，但在2.5 mM葡萄糖混養(yǎng)條件下，野生型藻株的生長(zhǎng)速率較光自養(yǎng)條件明顯加快，而Δslr0643藻株的生長(zhǎng)速率較光自養(yǎng)條件顯著下降，在添加葡萄糖其混養(yǎng)培養(yǎng) 4 d后的OD730值僅為野生型藻株的 47.25%，且其利用葡萄糖的速率也始終低于野生型藻株。在對(duì)培養(yǎng)液中24 h葡萄糖的消耗實(shí)驗(yàn)中，Δslr0643藻株在24 h內(nèi)消耗葡萄糖的速率始終慢于野生型，野生型培養(yǎng)液中的葡萄糖在22 h時(shí)已全部消耗完畢，而Δslr0643藻株在24 h時(shí)培養(yǎng)液中仍然剩余0.18 mM葡萄糖。通過(guò)代謝組學(xué)分別對(duì)野生型和Δslr0643藻株在不同培養(yǎng)時(shí)間下的顯著差異代謝物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)它們的顯著差異代謝物各有11種，均主要分屬于糖類、有機(jī)酸類、氨基酸類及脂類，其中有9種相同，但其表達(dá)量的變化卻截然不同，由此可看出slr0643基因的敲除影響了這些物質(zhì)的正常代謝。進(jìn)一步對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下Δslr0643突變體相對(duì)于野生型的差異代謝物進(jìn)行篩選鑒定，并將這些顯著差異代謝物的代謝通路進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)差異物質(zhì)主要富集在三羧酸循環(huán)，丙酮酸代謝，丁酸甲酯代謝，谷氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，淀粉和蔗糖代謝，煙酰胺代謝，磷酸肌醇代謝這8個(gè)代謝途徑，提示Slr0643主要是通過(guò)調(diào)控8個(gè)代謝通路來(lái)使細(xì)胞適應(yīng)葡萄糖的混養(yǎng)。本研究揭示了Slr0643在葡萄糖利用中的重要作用，為進(jìn)一步闡述Slr0643在集胞藻中的調(diào)控方式及藍(lán)藻對(duì)葡萄糖的利用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。