樊芳 馬清敏 趙智華 李科軍 趙曉彬 田凈凈 賈志旸

青光眼是眼科疾病中發(fā)病率最高的一種不可逆性致盲疾病。據(jù)統(tǒng)計，全球40～80歲人群中，青光眼的患病率約為3.5%。有報道指出，2013年全球青光眼患者數(shù)達(dá)6300萬，預(yù)計到2040年青光眼的患病人數(shù)將達(dá)到1.12億[1-2]。因此，青光眼已經(jīng)成為全球性公共衛(wèi)生問題?？刂蒲蹓菏侵委熐喙庋鄣闹饕侄危谒幬锖图す獠荒芸刂蒲蹓旱那闆r下，青光眼濾過手術(shù)(GFS)是目前控制眼壓的首選治療手段。雖然該手術(shù)有確切的治療效果，但是由于術(shù)后結(jié)膜下組織過度增生并形成瘢痕，導(dǎo)致GFS的手術(shù)失敗率高達(dá)35%～43%[3]。術(shù)中抗代謝藥物的局部應(yīng)用雖然可以抑制瘢痕生成，提高手術(shù)成功率，但是此類藥物也常常會導(dǎo)致濾過泡發(fā)生滲漏等嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此，尋找一種簡單、有效且副作用少的方法抑制GFS術(shù)后瘢痕化的進(jìn)程，對提高該手術(shù)成功率十分必要。

K115是一種Rho蛋白激酶抑制劑，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架作用強(qiáng)度拉伸小梁網(wǎng)。它作為一種新型的降眼壓藥物，對原發(fā)性開角型青光眼和高眼壓癥有明確的降眼壓效果[4-7]。目前已被日本批準(zhǔn)為降眼壓藥物，其他國家也在積極推廣K115在臨床上的應(yīng)用[8-9]。因此，對K115作用機(jī)制的深入探討顯得非常有意義。已有研究表明，K115介導(dǎo)的信號通路還參與調(diào)控細(xì)胞的遷移等運動過程[10]。除了具有降眼壓效果之外，K115還有促進(jìn)角膜上皮損傷恢復(fù)，誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細(xì)胞遷移，減輕眼內(nèi)炎癥,保護(hù)視神經(jīng)等多種功能[11-15]。K115是否也參與調(diào)控GFS術(shù)后瘢痕化進(jìn)程，且能否應(yīng)用于GFS術(shù)后抗瘢痕治療，尚缺乏明確的證據(jù)。本研究探討K115對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞增殖和遷移的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行研究，為GFS術(shù)后抗瘢痕治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗混合液、Hanks液、PBS液、凍存液(美國Gibco公司)， CCK-8 (日本同仁公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，TGF-β1(美國Peprotech公司)，K115(美國MCE公司)。

1.1.2 主要儀器超凈工作臺(HFsafe1200，上海力康發(fā)展有限公司)，二氧化碳全濕空氣培養(yǎng)箱(MCO-15AC，德國Heraeus公司)，倒置相差顯微鏡、倒置相差熒光顯微鏡(HF104F，日本Nikon公司)，流式細(xì)胞儀(CytoFLEX，美國Beckmancoulter公司)，多功能離心機(jī)(LDZ5-2型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，自動多功能酶標(biāo)儀(Mustikan，芬蘭Labsystem公司),電熱恒溫水浴槽(SSW型，上海博訊實業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人Tenon 囊成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)人Tenon 囊成纖維細(xì)胞取自于河北省人民醫(yī)院眼科行青光眼手術(shù)的患者。手術(shù)中剪下患者Tenon囊組織(大小約5 mm×5 mm)，放置于裝有Hanks液的無菌離心管中，然后置于冰上低溫保存，隨即送往實驗室。將組織塊用Hanks液漂洗3～4次后剪為1 mm×1 mm×1 mm大小。之后，將組織塊在瓶壁上貼壁，等組織塊貼附牢固后再將組織塊置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 g·L-1青鏈霉素雙抗混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基中，放于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。待人Tenon 囊成纖維細(xì)胞從組織塊中爬出后吸除組織碎片并換液，每3 d更換培養(yǎng)基，在細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶時進(jìn)行傳代，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實驗。本研究遵循《赫爾辛基宣言》所要求的倫理學(xué)原則，實驗方案經(jīng)河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖的評價

1.2.2.1 CCK-8實驗檢測K115對人Tenon 囊成纖維細(xì)胞增殖的影響取3～6代生長的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞，以每孔5×103～10×103個接種于96孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長融合至70%～80%狀態(tài)時各組分別加入不同的誘導(dǎo)劑作用24 h進(jìn)行誘導(dǎo)，用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的光密度值從而反映細(xì)胞的增殖情況。

1.2.2.2 TGF-β1對細(xì)胞增殖最佳作用濃度及最佳作用時間的篩選將人Tenon 囊成纖維細(xì)胞以每孔5×103～10×103個接種于96孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長融合至70%～80%狀態(tài)時分別加入0.1 μg·L-1、1.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1TGF-β1分別作用12 h、24 h、48 h進(jìn)行誘導(dǎo)，用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的光密度值，分析TGF-β1對細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步篩選TGF-β1的最佳作用濃度及最佳作用時間。將濃度最小、細(xì)胞增殖最明顯的TGF-β1濃度定為最佳作用濃度，將時間最短細(xì)胞增殖最明顯的TGF-β1作用時間定為最佳作用時間。最終確定5.0 μg·L-1TGF-β1為最佳作用濃度，24 h是最佳作用時間(見圖1)。

1.2.2.3 K115對細(xì)胞增殖最佳作用濃度的篩選及實驗分組用5.0 μg·L-1TGF-β1處理細(xì)胞后，分別加入1.0 μmol·L-1、5.0 μmol·L-1、10.0 μmol·L-1、20.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1K115進(jìn)一步處理細(xì)胞24 h，應(yīng)用CCK-8實驗檢測篩選K115的起始作用濃度及最佳作用濃度。將開始出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制作用的濃度定為起始作用濃度，將對細(xì)胞增殖抑制作用強(qiáng)的最小濃度定為最佳作用濃度。最終確定5.0 μmol·L-1K115為起始作用濃度，而10.0 μmol·L-1K115為最佳作用濃度(見圖2)。后續(xù)實驗依據(jù)這兩個濃度進(jìn)行分組，分別是對照組(不加TGF-β1與K115)，TGF-β1組(加5.0 μg·L-1TGF-β1)，TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組(加5.0 μg·L-1TGF-β1和5.0 μmol·L-1K115)，TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組(加5.0 μg·L-1TGF-β1和10.0 μmol·L-1K115)。

1.2.3 Transwell 實驗檢測K115對人Tenon 囊成纖維細(xì)胞遷移的影響取3～6代生長的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞，消化后接種于六孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。各組加入含不同誘導(dǎo)劑的DMEM懸浮細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度到200×103個·mL-1。在下室中加入600 μL 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個復(fù)孔。置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，吸干上室液體，移到預(yù)先加入800 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min。吸干上室固定液并用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上未遷移的細(xì)胞，用4 g·L-1臺盼藍(lán)染色10～15 min，然后用PBS清洗3次以上。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 免疫熒光法測定人Tenon 囊成纖維細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá)取3～6代生長的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞，消化后接種于六孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。加入不同誘導(dǎo)劑處理48 h后，用預(yù)冷的PBS洗3次，之后用40 g·L-1多聚甲醛固定過夜，再用Triton X-100處理細(xì)胞20 min；隨后用山羊血清封閉30 min，加入兔抗人α-SMA抗體(1500)，置于4 ℃冰箱中過夜；用PBS沖洗3次，滴加山羊抗兔熒光二抗(1100)，置于常溫下避光孵育1 h；用PBS沖洗3次后添加DAPI常溫避光孵育5 min ，再用PBS沖洗3次后在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況取3～6代生長的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞，消化后制備細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至每孔100× 103個，加入不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，獲取單細(xì)胞懸液；加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，之后分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC及5 μL PI混勻，避光反應(yīng)10 min左右，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)情況組織塊培養(yǎng)2～3周時可見人Tenon 囊成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，6～8周可見人Tenon 囊成纖維細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底；細(xì)胞體積大，呈扁平長梭形、卵圓形，核居中，細(xì)胞呈螺旋狀排列。

2.2 K115對細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖情況結(jié)果顯示，對照組、TGF-β1組、TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組、TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組光密度值分別為0.977±0.042、1.306±0.059、0.862±0.035、0.558±0.042，TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組、TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組光密度值均小于TGF-β1組 (均為P<0.05)，并且呈濃度依賴性減小，K115濃度越大細(xì)胞增殖減少幅度越大。

2.3 K115對人Tenon 囊成纖維細(xì)胞遷移的影響Transwell 實驗結(jié)果顯示，對照組、TGF-β1組、TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組、TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(38.67±3.06)個、(81.00±4.00)個、(44.33±3.21)個、(23.67±2.52)個；TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組與對照組比較，遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與TGF-β1組比較，遷移細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組與對照組及TGF-β1組比較，遷移細(xì)胞數(shù)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.4 K115對人Tenon 囊成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的影響各組細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組人Tenon 囊成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)可見散在分布的綠色熒光物質(zhì)， TGF-β1處理后24 h(TGF-β1組)，胞漿內(nèi)綠色絲狀熒光物質(zhì)明顯增加，熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組和 TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組細(xì)胞胞漿內(nèi)的熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性減弱，K115濃度越高熒光強(qiáng)度減弱越明顯(均為P<0.05) (見圖3) 。

圖3 免疫熒光染色結(jié)果顯示各組細(xì)胞胞漿中α-SMA表達(dá)情況

2.5 流式細(xì)胞儀檢測K115對細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為(2.400±0.346)%，TGF-β1組為(0.900±0.173)%，TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組為(1.333±0.252)%，TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組為(1.067±0.058)%；TGF-β1組的細(xì)胞凋亡率較對照組降低(P<0.05)； TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組和TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組的細(xì)胞凋亡率均較對照組降低(均為P<0.05)，而與TGF-β1組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。

3 討論

GFS是治療青光眼的主要手段，而GFS術(shù)后濾過道的瘢痕化是手術(shù)失敗的主要原因。解決術(shù)后的瘢痕化是目前眼科醫(yī)師關(guān)注的重點。我們通過TGF-β1誘導(dǎo)建立了人Tenon 囊成纖維細(xì)胞活化模型，在體外模擬濾過道瘢痕形成的進(jìn)程。K115是一種通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架降低眼壓的抗青光眼藥物，該藥物同時存在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)及運動的作用，這一作用是否可以參與調(diào)控肌成纖維細(xì)胞的遷移、增殖進(jìn)而發(fā)揮抗瘢痕作用是本研究的重點。

本研究首先觀察了TGF-β1誘導(dǎo)對細(xì)胞的增殖作用，并確定了TGF-β1的最佳作用時間和最佳作用濃度，根據(jù)研究結(jié)果，應(yīng)用5.0 μg·L-1TGF-β1作用24 h，建立了人Tenon 囊成纖維細(xì)胞活化模型。進(jìn)一步根據(jù)K115起始作用濃度5 μmol·L-1,最佳作用濃度10 μmol·L-1，作為后續(xù)實驗制定分組依據(jù)。采用CCK8實驗對各組細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了進(jìn)一步評價，結(jié)果提示，K115可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)濃度依賴性。應(yīng)用Transwell實驗對各組細(xì)胞遷移能力測定的結(jié)果顯示，對照組的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞存在一定的遷移，添加TGF-β1后細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，提示活化細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)；而TGF-β1+5.0 μmol·L-1K115組、TGF-β1+10.0 μmol·L-1K115組細(xì)胞遷移能力均明顯降低，且具有濃度依賴性。以上兩項檢查結(jié)果提示，K115可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移，從而抑制瘢痕形成。這與Futakuchi等[16]在人眼結(jié)膜成纖維細(xì)胞上的研究結(jié)果是一致的。

α-SMA是一種在活化狀態(tài)下人Tenon 囊成纖維細(xì)胞即肌成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)的蛋白，是一種活化的特異性蛋白，它的大量出現(xiàn)往往提示細(xì)胞的活化。肌成纖維細(xì)胞的遷移、增殖以及表達(dá)膠原蛋白的能力較成纖維細(xì)胞明顯增加，以往研究已證實該細(xì)胞的大量生成是導(dǎo)致局部瘢痕形成的重要環(huán)節(jié)[17-18]。本研究探討了K115對人Tenon 囊成纖維細(xì)胞中 α-SMA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，對照組人Tenon 囊成纖維細(xì)胞可見綠色絲狀熒光物質(zhì)，提示正常細(xì)胞保持一定水平的α-SMA表達(dá)，細(xì)胞本身處于一定的活化水平。TGF-β1作用后細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)明顯增多，細(xì)胞的活化水平提高；而K115可以抑制細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控人Tenon 囊成纖維細(xì)胞的活化及向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步影響了細(xì)胞的增殖及遷移。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1組細(xì)胞凋亡率降低，提示TGF-β1具有促進(jìn)細(xì)胞活化的作用，降低了細(xì)胞的凋亡比例；與TGF-β1組相比，K115處理后細(xì)胞凋亡率并未增加，提示K115對細(xì)胞的抑制作用并非通過凋亡通路來實現(xiàn)。

本研究結(jié)果提示，K115可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞的增殖與遷移，其作用機(jī)制可能與K115抑制了細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控了細(xì)胞活化有關(guān)。由此推測，K115具有調(diào)控瘢痕形成的作用，該調(diào)控的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。