石磊 王愛媛 歸東梅 楊宏偉

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是導(dǎo)致視力不可逆喪失的主要原因之一[1-2]，其病因是多因素的，其中包括陽光照射[3]。陽光中紫外線B(ultraviolet，UVB)是皮膚癌和眼部疾病的主要病因，如AMD[4-5]。在視網(wǎng)膜中，視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用，是視覺的重要調(diào)節(jié)因子[6]。RPE細(xì)胞的死亡和功能障礙與AMD的發(fā)病密切相關(guān)，AMD的早期和關(guān)鍵事件使RPE細(xì)胞變性和損害[7]，繼而導(dǎo)致感光細(xì)胞死亡、視力喪失。

導(dǎo)致AMD發(fā)生的許多病理因素需要RPE細(xì)胞中細(xì)胞自噬-溶酶體途徑(autophagy lysosome pathway,ALP)和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)降解和循環(huán)[8]，因此，這兩個(gè)系統(tǒng)在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中有重要作用。越來越多的研究表明，RPE細(xì)胞自噬能力的損害與AMD的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。然而UVB是否通過改變RPE細(xì)胞自噬導(dǎo)致AMD的發(fā)生發(fā)展仍然未知。本研究擬用人RPE細(xì)胞株ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行UVB照射，檢測(cè)UVB對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及其自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料ARPE-19細(xì)胞株來自美國(guó)菌種保存中心(ATCC)。紫外線劑量計(jì)購自Daavlin 公司(美國(guó))。細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定試劑盒CDG1、雷帕霉素(rapamycin，RAPA)、 環(huán)氧霉素(epoxomicin， EPO)、青霉素和鏈霉素、氯化銨(NH4Cl)購自Sigma公司(美國(guó))?？笲eclin-1、抗LC3、抗p62、抗β-actin和抗山羊-HRP購自Santa Cruz Biotechnology(美國(guó))?？雇?HRP和抗鼠-HRP等二抗購自GE公司(美國(guó))。DMEM和胎牛血清購自Gibco公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與UVB照射ARPE-19細(xì)胞在添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM中保存。細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下加濕培養(yǎng)。細(xì)胞用PBS洗2次后，加入PBS覆蓋，用UVB照射儀(Joland,美國(guó)) 進(jìn)行不同劑量UVB照射(UVB照射組)，用IL1400A 放射計(jì)聯(lián)合UVB探測(cè)儀(美國(guó)國(guó)際光學(xué)公司)檢測(cè)UVB輸出劑量。照射后細(xì)胞置于新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 UVB照射對(duì)細(xì)胞生存的影響采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生存情況，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞按每孔104個(gè)鋪于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，PBS洗2次，每孔加入30 μL PBS，不同劑量(50 mJ·cm-2、100 mJ·cm-2和200 mJ·cm-2)UVB照射， 未照射組作為對(duì)照組。照射后加入完全培養(yǎng)液，分別在照射后0 h、12 h、24 h、48 h收集細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。每孔加10 μL MTT 培養(yǎng)4 h,離心后棄掉上清，加100 μL DMSO，遮光振蕩10 min。用多孔分光光密度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)物的光密度，波長(zhǎng)570 nm。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分比表示。

1.2.3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)為了檢測(cè)UVB照射是否導(dǎo)致細(xì)胞自噬的變化，采用Western blot檢測(cè)標(biāo)志細(xì)胞自噬激活的LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)水平，并計(jì)算了LC3-I轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)C3-II的比率(反映自噬流的主要指標(biāo))。培養(yǎng)于10 cm 培養(yǎng)皿中的ARPE-19 細(xì)胞用于Western blot 檢測(cè)。采用UVB毒性實(shí)驗(yàn)中篩選出合適UVB劑量(100 mJ·cm-2) 照射，并于合適時(shí)間(24 h)收集細(xì)胞，在照射后更換培養(yǎng)液時(shí)分別加入RAPA(50 nmol·L-1)、NH4Cl(20 mmol·L-1)或者EPO(100 nmol·L-1)。處理后的ARPE-19細(xì)胞用PBS洗2次，然后用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，用Bradford蛋白檢測(cè)法檢測(cè)蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。一抗孵育后，用連接HRP的二抗孵育，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)免疫反應(yīng)蛋白。應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行定量，并與對(duì)照組比較。

1.2.4 細(xì)胞自噬對(duì)于細(xì)胞生存的影響分析照射后分別加入完全培養(yǎng)液、含有RAPA(50 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)液或含NH4Cl(20 mmol·L-1)的完全培養(yǎng)液，分組如下：UVB照射組、RAPA組、UVB+RAPA組、NH4Cl組、UVB+NH4Cl組，MTT法檢測(cè)同前。蛋白降解有兩個(gè)主要通路[11]:ALP和UPS，兩者之間有交互作用。為了確定UVB對(duì)細(xì)胞自噬的作用是否受UPS變化的影響，應(yīng)用EPO抑制UPS，應(yīng)用RAPA作為細(xì)胞自噬增強(qiáng)劑，檢測(cè)自噬蛋白的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用student’st-test方法進(jìn)行分析， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 UVB照射對(duì)ARPE-19細(xì)胞生存的影響與對(duì)照組相比，UVB照射組ARPE-19細(xì)胞出現(xiàn)劑量依賴性生存下降(圖1)，50 mJ·cm-2UVB照射后細(xì)胞生存無明顯改變；100 mJ·cm-2和200 mJ·cm-2UVB照射后12 h細(xì)胞生存與對(duì)照組相比無明顯改變；100 mJ·cm-2UVB照射后24 h及48 h細(xì)胞生存率分別為(76.9±1.5)%和(80.3±2.0)%，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；200 mJ·cm-2UVB照射后24 h及48 h細(xì)胞生存率分別為(47.5±1.9)%和(52.3±1.3)%，與對(duì)照組相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。與照射后24 h相比，100 mJ·cm-2、200 mJ·cm-2UVB照射后48 h的細(xì)胞生存率均出現(xiàn)了一定程度的恢復(fù)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。為便于后續(xù)研究，選擇了引起細(xì)胞明顯死亡并且細(xì)胞生存率大于50%的UVB照射劑量和時(shí)間點(diǎn)(100 mJ·cm-2UVB，24 h)收集細(xì)胞進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。

圖1 MTT法檢測(cè)不同劑量UVB照射對(duì)ARPE-19細(xì)胞生存率的影響 與對(duì)照組(0 mJ·cm-2UVB)相比，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 UVB照射抑制ARPE-19細(xì)胞中Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)UVB照射組ARPE-19細(xì)胞照射后24 h，細(xì)胞出現(xiàn)LC3-II/LC3-I比率明顯下降，與對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2A、2B)；UVB照射組ARPE-19細(xì)胞照射后24 h，細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)水平下降，與對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) (圖2A、2C)。

圖2 UVB照射降低ARPE-19細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比率及Beclin-1蛋白表達(dá)水平 A：100 mJ·cm-2UVB照射ARPE-19細(xì)胞后，約2 min獲得所需劑量，24 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blot檢測(cè)LC3和Beclin-1蛋白的表達(dá)水平。B 和C分別為采用Image J軟件定量分析LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，**P<0.01。

2.3 自噬增強(qiáng)劑逆轉(zhuǎn)了UVB照射對(duì)自噬流的抑制作用應(yīng)用RAPA為自噬增強(qiáng)劑，NH4Cl為自噬溶酶體阻滯劑，檢測(cè)自噬的增強(qiáng)或抑制能否逆轉(zhuǎn)或增強(qiáng)UVB的作用。結(jié)果顯示，在LC3蛋白的表達(dá)及LC3-II/LC3-I比率上，UVB+RAPA組與對(duì)照組、UVB照射組相比，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(圖3A、3B)，RAPA逆轉(zhuǎn)了UVB照射降低LC3-II/LC3-I比率的作用；NH4Cl則進(jìn)一步增強(qiáng)了UVB照射的作用。對(duì)照組與其余各組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I、Beclin-1蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3A、3C)；RAPA和NH4Cl對(duì)于UVB照射抑制Beclin-1蛋白表達(dá)水平的作用均有一定程度的逆轉(zhuǎn)，雖然未達(dá)到對(duì)照組水平，但UVB+RAPA組、UVB+NH4Cl組與UVB照射組相比，顯著增強(qiáng)了Beclin-1蛋白的表達(dá)(均為P<0.01)(圖3A、3C)。

圖3 RAPA逆轉(zhuǎn)了UVB照射對(duì)自噬流的抑制作用 A：UVB照射ARPE-19細(xì)胞后，用含50 nmol·L-1 RAPA或20 mmol·L-1 NH4Cl的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)水平。B和C為Image J軟件定量分析LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，*P<0.05、**P<0.01；與UVB照射組相比，#P<0.05、##P<0.01。

2.4 抑制UPS可以部分逆轉(zhuǎn)UVB照射對(duì)于自噬啟動(dòng)的抑制與對(duì)照組相比，RAPA組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比率提高，Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低(均為P<0.01)。與對(duì)照組相比，EPO組LC3-II/LC3-I比率提高，Beclin-1蛋白表達(dá)水平增加(P<0.01)；EPO并未逆轉(zhuǎn)UVB照射引起的LC3-II/LC3-I比率的降低，UVB+EPO組未能使Beclin-1蛋白表達(dá)水平恢復(fù)到對(duì)照組水平(P<0.05)，但UVB+EPO組與UVB照射組相比，細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比率無改變(P>0.05),Beclin-1蛋白表達(dá)水平差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。

2.5 UVB照射誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞死亡不受細(xì)胞自噬變化的影響UVB照射組使用UVB照射ARPE-19細(xì)胞后24 h檢測(cè)細(xì)胞生存率，結(jié)果顯示，UVB誘導(dǎo)后細(xì)胞死亡率約25%，與對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；RAPA誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡，RAPA組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NH4Cl不影響細(xì)胞生存，NH4Cl組與對(duì)照組相比，細(xì)胞死亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與UVB照射組相比,UVB+RAPA組和UVB+NH4Cl組細(xì)胞死亡率無明顯差異(P>0.05)(圖5)。

圖4 抑制UPS可以部分逆轉(zhuǎn)UVB對(duì)于自噬啟動(dòng)的抑制 A：UVB照射ARPE-19細(xì)胞后用含50 nmol·L-1 RAPA或100 nmol·L-1 EPO的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)水平。B和C為Image J軟件定量分析LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，**P<0.01； 與UVB照射組比較，##P<0.01。

圖5 自噬改變不影響UVB照射誘導(dǎo)的ARPE-19死亡 UVB照射后用含50 nmol·L-1 RAPA或50 mmol·L-1 NH4Cl的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分比表示，與對(duì)照組相比，*P<0.05，** P<0.01。

3 討論

AMD患者視力的缺失與RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞的退化有關(guān)[12],RPE是一個(gè)極化的單層上皮細(xì)胞層，位于神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間，能夠選擇性吸收較低波長(zhǎng)的光粒子，因此，RPE是UVB的主要感受器細(xì)胞。有研究表明，UVB可通過激活MAP信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，并導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組與能量穩(wěn)態(tài)破壞、氧化應(yīng)激、DNA損傷反應(yīng)以及光感受器基質(zhì)成分及其細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)和功能損傷[14]。UVB可導(dǎo)致RPE細(xì)胞活性氧(ROS)升高，激活Notch通路損傷RPE細(xì)胞[15]。盡管大量的研究對(duì)UVB導(dǎo)致AMD發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行了探索，但確切的發(fā)生機(jī)制仍然有待研究。

UVB照射產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可以引起RPE細(xì)胞內(nèi)蛋白錯(cuò)誤折疊及蛋白聚集，這與AMD的發(fā)生密切相關(guān)[10]。細(xì)胞中降解受損及不需要蛋白的途徑主要是UPS和ALP，其中ALP與AMD發(fā)生的關(guān)系近年來得到了大家的廣泛關(guān)注，越來越多的研究證實(shí)AMD中自噬功能異常[8,10]。自噬是一種細(xì)胞保護(hù)過程，在各種壓力下維持穩(wěn)態(tài)，消除有缺陷的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器。自噬在細(xì)胞中具有多重作用，上調(diào)自噬可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]，自噬功能的損害可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生[17]，包括AMD[18]。在皮膚細(xì)胞中，UVB與自噬的關(guān)系的研究較多，但得到的結(jié)果完全不同：在人真皮成纖維細(xì)胞及角化細(xì)胞中UVB照射損傷了自噬[19-20]；然而另外的研究認(rèn)為，UVB照射誘導(dǎo)了人真皮成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞的自噬[21-23]，而且在小鼠表皮細(xì)胞中得到了同樣的結(jié)論[24]。造成不同結(jié)果的原因尚未完全清楚，但是自噬的調(diào)節(jié)過程受到多種因素的影響。因此，在不同條件下，不同組織、不同細(xì)胞中自噬的變化是多樣的。

本研究結(jié)果顯示，UVB照射降低了ARPE-19細(xì)胞中，LC3-II/LC3-I比率，LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換減少，提示自噬流下降；降低了Beclin-1蛋白表達(dá)水平，因?yàn)锽eclin-1蛋白是自噬體形成的關(guān)鍵材料，是自噬啟動(dòng)的標(biāo)志之一[25]，說明UVB照射抑制了自噬的啟動(dòng)。自噬增強(qiáng)劑RAPA可逆轉(zhuǎn)了UVB照射降低的ARPE-19細(xì)胞中，LC3-II/LC3-I比率，自噬抑制劑NH4Cl則增強(qiáng)了UVB照射導(dǎo)致的LC3-II/LC3-I減少，進(jìn)一步證了UVB照射對(duì)于自噬流的抑制作用。雖然調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的復(fù)雜機(jī)制有待于確定，但兩個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)已經(jīng)明確，即mTOR/ULK1和Beclin-1/PI3K-Class III通路[26]。 Beclin-1在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬中的作用比較復(fù)雜，連接的分子伴侶不同，導(dǎo)致其具有誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞自噬相反作用[27]。本研究中RAPA和NH4Cl雖然降低了ARPE-19細(xì)胞中Beclin-1蛋白的表達(dá)，但是卻一定程度地逆轉(zhuǎn)了UVB照射的抑制作用。RAPA通過抑制mTOR通路激活細(xì)胞自噬，NH4Cl通過阻止自噬體-溶酶體融合而抑制自噬，兩種自噬調(diào)節(jié)劑具有相反的調(diào)節(jié)作用，由于作用的通路不同，因此，和UVB照射聯(lián)合作用造成的壓力可能在一定程度上刺激了Beclin-1蛋白反應(yīng)性的表達(dá)增加，這需要未來更確切的證據(jù)進(jìn)一步證明。

由于RPE細(xì)胞中自噬與UPS之間具有交互作用[11]，UPS的抑制可以激活細(xì)胞自噬，但是細(xì)胞自噬的抑制則損害了UPS。為了觀察UVB照射對(duì)于ARPE-19細(xì)胞自噬的作用是否受UPS的影響，我們應(yīng)用蛋白酶抑制劑EPO作用于UVB照射后的ARPE-19細(xì)胞，觀察自噬的變化，結(jié)果表明，EPO刺激細(xì)胞自噬的啟動(dòng)和自噬流的增加，對(duì)于由UVB照射所致的LC3-II/LC3-I比率降低沒有影響，但對(duì)UVB照射所致的Beclin-1蛋白降低有一定的逆轉(zhuǎn)作用。UPS對(duì)于UVB照射作用的影響在不同的階段不盡相同，既不影響UVB照射抑制自噬流的作用，又可一定程度上逆轉(zhuǎn)UVB照射對(duì)自噬啟動(dòng)的抑制。

有研究表明，細(xì)胞自噬的改變能夠影響細(xì)胞生存[16]，本研究結(jié)果顯示，UVB照射照射誘導(dǎo)了ARPE-19細(xì)胞死亡，并且增強(qiáng)或抑制細(xì)胞自噬均無逆轉(zhuǎn)UVB照射照射的作用，因此，我們認(rèn)為UVB照射導(dǎo)致RPE細(xì)胞死亡與細(xì)胞自噬的改變無關(guān)。

綜上，UVB照射可以抑制ARPE-19細(xì)胞自噬的啟動(dòng)及自噬流，UPS的改變不影響UVB照射對(duì)于自噬流的作用，但一定程度上減輕了UVB照射對(duì)細(xì)胞自噬啟動(dòng)的抑制。UVB照射通過誘導(dǎo)RPE細(xì)胞死亡、損害RPE細(xì)胞自噬能力增加變性，從而導(dǎo)致AMD的發(fā)生。