楊翔 羅杰 萬文輝 李翰卿 貢歌 張瑗 陳陽希 劉瑜 張興虎

隨著增齡，機(jī)體的免疫功能明顯減退，其主要原因就是免疫細(xì)胞的數(shù)量及功能下降，減弱了機(jī)體的抵抗力，從而導(dǎo)致老年人感染性疾病及腫瘤的發(fā)病率明顯增加[1]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)是一組具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，是機(jī)體維持自身耐受的重要成分。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)衰老時(shí),Treg細(xì)胞的表達(dá)和功能會(huì)發(fā)生變化，這種質(zhì)和量的改變可能與老年人多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[2]。目前國內(nèi)外涉及老年人外周血Treg的研究不多，而涉及高齡老年人的此類研究幾乎沒有。細(xì)胞衰老的另一個(gè)關(guān)鍵特征之一是細(xì)胞因子水平的改變。本研究主要觀察青年人、中老年人及高齡老年人外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)，并計(jì)算前者占后者的百分比，同時(shí)觀察3組人群外周血IL-2、干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-10和IL-17水平的差異，以進(jìn)一步研究增齡對(duì)免疫衰老及衰老微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)抽取2018～2019年門診或住院體檢者，按年齡分為3組,每組40例?！?0歲為高齡老年組，平均(90.4±8.1)歲，其中男23例，女17例；年齡50～75歲為中老年組，平均(64.1±9.8)歲，其中男25例，女15例；年齡20～45歲為青年組，平均(37.9±8.2)歲，其中男24例，女16例。排除腫瘤、糖尿病、急慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)劑治療的病人。

1.2 主要儀器及試劑 CD4-FITC/CD25-APC/Foxp3-PE檢測(cè)試劑盒(FITC標(biāo)記的抗人CD4、APC標(biāo)記的抗人CD25及PE標(biāo)記的抗人Foxp3)購自美國 Ebioscience公司，所用流式細(xì)胞儀及數(shù)據(jù)分析軟件為德國美天旎公司MACS Quant Analyzer。細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司，所用流式細(xì)胞儀及數(shù)據(jù)分析軟件為Beckman公司生產(chǎn)的Navios。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 外周血CD4+T和 CD4+CD25+Foxp3+Treg的檢測(cè)：樣本管和對(duì)照管分別加入細(xì)胞表面標(biāo)記抗體CD4-FITC/CD25-APC 10μL，渦旋混勻后避光孵育15 min； 每管內(nèi)加入細(xì)胞核破膜劑(破膜劑棕瓶：破膜劑buffer白瓶=1∶3配置)，充分渦旋混勻，室溫避光放置1 h。1500 r/min離心8 min，棄上清；加入2 mL的破膜buffer (破膜buffer原液∶蒸餾水=1∶9配置)，1500 r/min離心8 min，棄上清； 加入試劑盒中胎牛血清1μL避光孵育15 min(防止非特異性吸附)，隨后樣本管加入Foxp3-PE抗體10μL，對(duì)照管加入10μL Mouse IgG1-PE 作為同型對(duì)照，輕輕渦旋混勻，室溫避光放置1 h；加入2 mL的破膜buffer，1500 r/min離心8 min，棄上清；加入450μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 外周血 IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-7水平的檢測(cè)：向標(biāo)準(zhǔn)品管中加入25μL基質(zhì)B和25μL校準(zhǔn)液，向樣本管中加入25μL實(shí)驗(yàn)緩沖液和25μL樣本；向所有管中加入25μL捕獲微球抗體(按2∶1充分混合均勻)，再加入25μL檢測(cè)抗體，室溫(25±1℃)避光震蕩孵育2 h(400～500 r/min)；向所有管中加入25μL藻紅蛋白標(biāo)記的鏈酶親和素 (SA-PE)，室溫(25±1℃)避光震蕩孵育0.5 h(400～500 r/min)；向每管中加入500μL洗滌緩沖液，渦旋5 s，300～500 r/min離心5 min，緩慢傾倒出液體，倒扣于吸水紙上；根據(jù)流式細(xì)胞儀上樣需求，向每管中加入150～300μL洗滌緩沖液，渦旋10 s將微球重懸，立即上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血CD4+T細(xì)胞和 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及后者占CD4+T細(xì)胞百分比比較 本研究發(fā)現(xiàn)，中老年組外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和青年組相比無明顯變化(P>0.05)，而高齡老年組CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)與前兩組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高齡老年組和中老年組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均明顯高于青年組(P<0.05)，而高齡老年組和中老組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中老年組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比明顯高于青年組，高齡老年組明顯高于中老年組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組CD4+T細(xì)胞和 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及后者占CD4+T細(xì)胞百分比

2.2 3組外周血IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-17水平比較 本研究發(fā)現(xiàn)，高齡老年組IL-2、IFN-γ和IL-17水平明顯低于青年組和中老年組(P<0.05)；中老年組IL-2水平明顯低于青年組(P<0.05)；高齡老年組IL-10水平明顯高于青年組和中老年組(P<0.05)，3組 TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；青年組和中老年組IFN-γ、IL-10和IL-17水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 3組外周血IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-7水平的比較

3 討論

人口老齡化已是一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，隨著增齡，機(jī)體一個(gè)明顯的特點(diǎn)就是免疫功能衰退，最突出的表現(xiàn)是T細(xì)胞數(shù)量減少、增殖能力下降，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)遲緩及功能低下[3]。這種狀況現(xiàn)正日益受到人們的重視，也是目前免疫領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

有研究表明，老年人外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞水平均有明顯降低，CD4+/CD8+比例降低[4]，T細(xì)胞不能有效識(shí)別抗原，不能有效清除病原體[5]。Treg細(xì)胞是機(jī)體維持自身耐受的重要成分，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞來源于胸腺，人和小鼠的Treg細(xì)胞可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，減弱其活化并降低細(xì)胞因子的分泌，從而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫抑制作用[2,6-7]。

體內(nèi)組織微環(huán)境中Treg細(xì)胞亞群功能的穩(wěn)定性及其調(diào)控是當(dāng)今免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]，關(guān)于Treg細(xì)胞與年齡相關(guān)的免疫應(yīng)答下降相關(guān)的研究結(jié)論尚未達(dá)成一致[9]。目前國內(nèi)外針對(duì)高齡老年人Treg的研究基本沒有。本研究把青年人、中老年人和高齡老年人作為觀察對(duì)象，研究人體外周血CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)以及IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-17水平的變化與增齡的關(guān)系。結(jié)果提示，高齡老年人外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)較青年人和中老年人有明顯下降，高齡老年人和中老年人外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均明顯高于青年人，隨著增齡，人體外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比逐漸增高。說明隨著增齡，T細(xì)胞免疫功能進(jìn)一步下降，機(jī)體內(nèi)Treg細(xì)胞已打破與其他T細(xì)胞間的平衡。到目前為止，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞隨著增齡增多的原因還不十分清楚，有研究者認(rèn)為CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞增齡性增多的原因可能與人體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β堆積有關(guān)，因?yàn)檗D(zhuǎn)化生長因子β可以誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞，而CD4+CD25+T細(xì)胞可以高表達(dá)Treg細(xì)胞的表面分子Foxp3，同時(shí)還能夠抑制淋巴細(xì)胞分化增殖[10]。

細(xì)胞衰老的關(guān)鍵特征之一是細(xì)胞促炎因子和趨化因子等分泌的改變[11]。CD4+T細(xì)胞主要分為Th1和Th2兩類亞群，Th1細(xì)胞分泌IL-2、IL-17和IFN-γ等細(xì)胞因子，IL-2主要發(fā)揮促炎和刺激T細(xì)胞增殖的作用。IL-17能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)。IFN-γ通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞和IL-2R表達(dá)[12]。Th2細(xì)胞分泌IL-10和IL-6等細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)，高齡老年組IL-2、IFN-γ和IL-17水平明顯低于青年組和中老年組，中老年組IL-2水平明顯低于青年組。IL-10可抑制CD4+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌，包括Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，但不能抑制IL-17細(xì)胞生成IL-17，IL-10表達(dá)過多時(shí)也會(huì)誘發(fā)人體某些疾病[13]。本研究發(fā)現(xiàn)高齡老年組IL-10水平明顯高于青年組和中老年組。以上觀察結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，進(jìn)一步證實(shí)隨著增齡人體免疫功能有進(jìn)一步下降趨勢(shì)。TNF-α由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，主要刺激機(jī)體炎癥反應(yīng)，也是導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)皮功能紊亂和內(nèi)膜增生的重要因素之一。有文獻(xiàn)報(bào)道感染、心腦血管疾病及糖尿病等病人體內(nèi)TNF-α水平是增高的[14-15]，但本研究發(fā)現(xiàn)健康高齡老年人TNF-α水平與青年組和中老年組并沒有明顯差異。

CD4+T細(xì)胞及Treg細(xì)胞的質(zhì)和量的變化與許多疾病的發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系，隨著增齡，機(jī)體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量增多，打破與其他T細(xì)胞間的平衡，引起老年個(gè)體免疫應(yīng)答能力的下降，從而可能出現(xiàn)對(duì)新抗原產(chǎn)生“免疫耐受”，導(dǎo)致易患感染性疾病和腫瘤等疾病，包括多種細(xì)胞因子在內(nèi)的老化的免疫微環(huán)境可能對(duì)腫瘤的進(jìn)展產(chǎn)生巨大影響[16]。研究CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞和衰老微環(huán)境的變化與增齡的關(guān)系，可以在一定程度上揭示機(jī)體免疫衰老的機(jī)理，但具體的機(jī)制還有待于大樣本的研究進(jìn)一步探討。