夏文豪　張　斌　梁建文　蘇　晨　張小宇　李　琰　陶　軍

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科，廣東　廣州　510080)

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增齡對內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能活性的影響及與血管內(nèi)皮功能的關(guān)系

夏文豪張斌梁建文蘇晨張小宇李琰陶軍

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科，廣東廣州510080)

〔摘要〕目的探討增齡對人外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能活性的影響及與血管內(nèi)皮功能的關(guān)系。方法入選32例健康老年人作為實驗組(老年組)和30例健康青年人為對照組(青年組)。抽取受試者外周靜脈血20 ml，采用密度梯度離心法分離提取內(nèi)皮祖細胞，采用流式細胞技術(shù)比較兩組志愿者循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量。體外培養(yǎng)7 d后，分別檢測兩組志愿者內(nèi)皮祖細胞體外遷移及黏附能力；通過裸鼠頸動脈拉脫模型，比較內(nèi)皮祖細胞在體內(nèi)皮損傷修復(fù)能力。檢測兩組志愿者血流介導(dǎo)的血管舒張功能(FMD)。結(jié)果與青年組相比，老年組外周血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量明顯下降(P<0.01)，體外遷移、黏附(P<0.01)及在體再內(nèi)皮化功能均明顯受損。減少的在體再內(nèi)皮化面積與下降的FMD之間呈正相關(guān)。結(jié)論增齡導(dǎo)致外周血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能活性受損與血管內(nèi)皮功能下降密切相關(guān)，是動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

〔關(guān)鍵詞〕增齡；內(nèi)皮損傷；內(nèi)皮功能；內(nèi)皮祖細胞

增齡是最常見的心血管危險因子之一，其導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一〔1,2〕。內(nèi)皮祖細胞(EPCs)能定向分化為內(nèi)皮細胞，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，是血管內(nèi)皮損傷修復(fù)最重要的機制之一〔3〕。然而，在心血管危險因素和疾病存在時，循環(huán)中EPCs的數(shù)量和功能逐漸下降，這種內(nèi)源性血管內(nèi)皮修復(fù)能力的減退是動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因〔4,5〕。當生理性衰老發(fā)生時，血管內(nèi)皮依賴舒張功能受損，而且這種血管功能障礙與循環(huán)EPCs數(shù)量減少密切相關(guān)，提示循環(huán)EPCs數(shù)量減少導(dǎo)致的內(nèi)源性血管修復(fù)能力下降是生理性衰老血管損傷的發(fā)病機制之一〔6〕。然而，增齡對EPCs數(shù)量和功能活性的影響及與血管內(nèi)皮功能之間的關(guān)系有待進一步研究。本研究主要探討增齡對EPCs數(shù)量和功能活性及血管內(nèi)皮功能的影響。

1資料與方法

1.1研究對象分別招募32名老年志愿者〔年齡(68±6.6)歲〕和30名青年志愿者〔年齡(26±5.8)歲〕參與實驗，分為老年組和青年組，兩組志愿者均無心血管危險因素、心血管病史及臨床證據(jù)。本研究方案得到我院倫理委員會批準，并與所有的研究對象簽署知情同意書。基線特征均在正常范圍，老年人與年輕人之間除年齡外其余特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1　兩組志愿者基線資料比較±s)

與青年組比較：1)P<0.01

1.2方法

1.2.1EPCs的分離和培養(yǎng)分別抽取兩組志愿者外周靜脈血30 ml，采用密度梯度離心法分離純化出外周血單個核細胞，重懸于EGM-2培養(yǎng)基(含20%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素0.1 mg/ml、VEGF 50 ng/ml)，接種于預(yù)先包被好纖維連接蛋白(5 μg/cm2)的細胞培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3 d后移除未貼壁懸浮細胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；每3 d換液，在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)的變化，培養(yǎng)至7 d左右的貼壁細胞即為實驗所用的EPCs〔7〕。

1.2.2EPCs的流式細胞計數(shù)培養(yǎng)7 d后，將貼壁細胞消化后重懸，每1×106個分置于EP管中，分別加入PE標記的鼠抗人CD31、KDR和CD133抗體各10 μl，陰性對照管加入PE標記的同型大鼠IgG抗體10 μl，4℃避光孵育30 min，250 r/min離心5 min，棄上清液，流式細胞檢測緩沖液洗滌2次，4%多聚甲醛溶液重懸，流式細胞儀檢測CD34+/KDR+及KDR+/CD133+陽性細胞數(shù)量。采用國際上公認CD34+/KDR+或KDR+/CD133+雙陽性定義為循環(huán)內(nèi)皮祖細胞。

1.2.3EPCs的體外遷移實驗培養(yǎng)7 d之后，將EPCs消化后重懸，將2×104個EPCs加入Boyden小室上室，置于24孔板中，在下室中加入500 μl的不含胎牛血清的EBM-2，然后加入100 ng/ml的SDF-1，將其置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24 h后取出Boyden小室，小心棄去上層液體，用棉簽小心擦掉小室濾膜孔上表面上未遷移的細胞；將Boyden小室置于4%多聚甲醛溶液中，固定10 min；熒光顯微鏡下觀察，選擇3個不同視野計數(shù)。

1.2.4EPCs的體外黏附實驗將培養(yǎng)的HUVECs消化、重懸，按3×105/孔接種到六孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后形成內(nèi)皮細胞單層后，加入1 μg/ml CM-DiI染料的無血清EGM-2培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；孵育10 min后，消化重懸；將消化重懸的內(nèi)皮祖細胞按1×105/孔加入上述準備好的內(nèi)皮細胞單層中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，DAPI溶液染色10 min，熒光顯微鏡下觀察，計算黏附于內(nèi)皮細胞單層上的EPCs數(shù)量。

1.2.5裸鼠頸動脈拉脫損傷模型(1)手術(shù)：取8～10周齡的裸鼠，腹腔注射水合氯醛進行麻醉，頸部正中切口游離、暴露頸外動脈后，在其下穿2根5-0絲線，距離大約0.5 cm，結(jié)扎遠端(靠近頭部端)。在2根絲線間頸外動脈上剪開一小口，插入直徑0.35 mm的金屬導(dǎo)絲至頸總動脈，旋轉(zhuǎn)進出3次，結(jié)扎頸外動脈近端。(2)EPCs移植：將培養(yǎng)7 d的EPCs消化，PBS緩沖液重懸為密度5×105/100 μl的細胞懸液置于37℃(EPCs示蹤實驗時EPCs先用CM-DiI標記)，拉脫手術(shù)約3 h后裸鼠蘇醒，將上述EPCs懸液按5×105/只從尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，對照組用不含細胞的PBS緩沖液或HUVEs注射。(3)伊文思藍染色：將手術(shù)3 d后的裸鼠麻醉，經(jīng)尾靜脈注入100 μl的5%伊文思藍溶液，10 min后打開頸部正中切口分離取出雙側(cè)頸總動脈，處死動物； 將動脈條置于PBS緩沖液中漂洗干凈后縱切開，內(nèi)膜朝上置于載玻片上拍照〔8〕。

1.2.6血流介導(dǎo)的血管舒張功能(FMD)檢測采用日本UNEXEF高分辨率超聲血管內(nèi)皮分析儀分析肱動脈血流介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能。受試者在測試前4 h禁食，12 h內(nèi)禁止吸煙、攝入酒精、咖啡因等，在一個安靜、溫度舒適的房間內(nèi)休息至少10 min后進行FMD測量。用帶有10 MHz的H型探頭，記錄基線時的右肱動脈縱向影像；然后在超收縮壓緊壓(右側(cè)前臂，緊壓5 min，超過收縮血壓50 mmHg)、充氣囊放氣后2 min之內(nèi)持續(xù)記錄二維灰度圖像和縱向平面中肱動脈的A-模型波。用心電圖R波，使之與每博肱動脈收縮直徑同步，自動跟蹤并持續(xù)記錄舒張直徑的變化。用反應(yīng)性充血期間最大擴張時的直徑變化百分比(相比于基線值)估算FMD。

2結(jié)果

2.1外周血中EPCs數(shù)量與青年組〔(0.043±0.008)%、(0.04±0.01)%〕相比，老年組外周血單核細胞中CD34+/KDR+雙陽性〔(0.027±0.006)%〕和KDR+/CD133+雙陽性細胞比例〔(0.022±0.006)%〕均顯著減低(P<0.01)。

2.2EPCs體外遷移實驗結(jié)果相比于青年組〔SDF-1(-):39±6,(+):67±11〕，老年組EPCs基礎(chǔ)遷移水平〔SDF-1(-):28±7〕降低(P<0.05)，SDF-1誘導(dǎo)的遷移能力減低〔SDF-1(+):46±9〕更為明顯(P<0.001)。見圖1。

2.3EPCs體外黏附實驗結(jié)果TNF-α(-)：青年組41±6，老年組22±7;TNF-α(+):青年組77±11;老年組58±9。熒光顯微鏡計數(shù)黏附在內(nèi)皮細胞單層的EPCs數(shù)量，老年組明顯低于青年組(P<0.05)，見圖2。

2.4EPCs體內(nèi)再內(nèi)皮化實驗結(jié)果相比于PBS組〔(12±3)%〕，青年組〔(58±9)%〕和老年組〔(34±7)%〕內(nèi)皮祖細胞損傷血管內(nèi)皮化面積明顯更大，老年組比青年組明顯少(P<0.01)。見圖3。

2.5增齡對血流介導(dǎo)的FMD的影響FMD老年組血流介導(dǎo)的FMD〔(6.3±1.1)%〕明顯減低(P<0.01)，青年組為(8.8±2.1)%，提示血管內(nèi)皮功能受損。

2.6血流介導(dǎo)的FMD與內(nèi)皮祖細胞內(nèi)皮化的關(guān)系無論青年組還是老年組，F(xiàn)MD與EPCs在體內(nèi)皮化面積之間存在明顯正相關(guān)(青年組：P<0.01,R2=0.692；老年組：P<0.01,R2=0.641)。見圖4。

Scale bar=100 μm圖1　EPCs外遷移能力比較(×100)

Scale bar=100 μm圖2　EPCs體外黏附能力(×100)

圖3　兩組志愿者EPCs在體內(nèi)皮化能力

圖4　FMD與EPCs在體內(nèi)皮化面積相關(guān)性分析

3討論

衰老引起的血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，而修復(fù)血管內(nèi)皮損傷是防治缺血性血管疾病的重要措施之一。國內(nèi)外研究表明：血管損傷時，內(nèi)皮祖細胞能歸巢到損傷內(nèi)皮局部，參與血管內(nèi)皮損傷修復(fù)過程，是血管內(nèi)皮損傷修復(fù)最重要的機制之一〔9～11〕。然而，在心血管危險因素和疾病的存在下，循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量和功能均下降，這種內(nèi)源性血管內(nèi)皮修復(fù)能力的減退是動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因〔12,13〕。

在既往的研究中，我們探討了衰老血管功能與循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衰老引起血管內(nèi)皮依賴舒張功能受損，而且這種血管功能障礙并且與循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量減少密切相關(guān)，提示循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量減少導(dǎo)致的內(nèi)源性血管修復(fù)能力下降是生理性衰老血管損傷的發(fā)病機制之一，然而血管衰老與內(nèi)皮祖細胞的功能活性有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)：增齡導(dǎo)致外周循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)后的內(nèi)皮祖細胞體外遷移、黏附功能活性明顯降低，提示其血管內(nèi)皮損傷修復(fù)能力可能減弱。通過建立裸鼠頸動脈內(nèi)皮拉脫損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與年輕人相比，老年人內(nèi)皮祖細胞頸動脈內(nèi)皮損傷修復(fù)的面積顯著減少，這進一步證實衰老導(dǎo)致內(nèi)皮祖細胞的內(nèi)源性修復(fù)能力的降低。

本研究結(jié)果為增齡所致心血管疾病的發(fā)生發(fā)展提供新思路，即增齡除對血管的直接損傷外，還可能間接通過減弱血管內(nèi)皮功能修復(fù)機制—內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量減少和功能減退而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，從而促進心血管事件的發(fā)生和發(fā)展。

4參考文獻

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〔2015-12-14修回〕

(編輯徐杰)

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81200249)；廣東省科技計劃項目(2016A020215056)；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院優(yōu)秀青年人才計劃(2012年)；中山大學(xué)青年教師培育項目(2014年)

通訊作者：陶軍(1961-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動脈粥樣硬化性心血管疾病研究。

〔中圖分類號〕R543.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3149-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.024

Effects of aging on the number and functional activity of endothelial progenitor cells and the relationship between vascular endothelial function

XIA Wen-Hao, ZHANG Bin, LIANG Jian-Wen,et al.

Department of Hypertension and Vascular Disease, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of aging on the quantity and functional activities of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) in healthy men.Methods32 healthy old people〔elderly group:(68±6.6) years old〕 and 32 healthy young people〔young group:(26±5.8) years old〕were enrolled into the research.EPCs were isolated and cultured from peripheral blood by density gradient centrifugation method, and the quantity of circulating EPCs was exterminated by flow cytometry analysis.Further, the migration and adhesion function in vitro and the reendothelialization capacity in vivo of EPCs from two groups subjects were measured.Moreover, the flow-mediated dilatation of two group subjects were exterminated.ResultsCompare with those of young group, the quantity (P<0.01), in vitro migration and adhesion (P<0.01) and in vivo reendothelialization capacity (P<0.001) of EPCs from aging group were significant declined.And the impaired endothelial repair capacity was positive relation with declined FMD.ConclusionsAge-related decline in quantity and function of human EPCs is close relation with decreasing endothelial function, which is an important risk factor for atherosclerotic vascular diseases.

【Key words】Aging;Endothelial injury;Endothelial function;Endothelial progenitor cells

·心、腦血管及代謝性疾病·

第一作者：夏文豪(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事老年心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。