孔　欣　禹文峰　官志忠

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴州　貴陽　550004)

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激活星形膠質(zhì)細胞α7乙酰膽堿能受體抑制β-淀粉樣蛋白的聚集

孔欣禹文峰1官志忠1

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴州貴陽550004)

〔摘要〕目的研究在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)加入尼古丁后能否激活細胞內(nèi)α7尼古丁乙酰膽堿能受體(nAChR)以及激活的α7nAChR對β-淀粉樣蛋白(Aβ)的降解作用。方法分離新生乳鼠大腦皮質(zhì)培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞并純化、傳代，使用細胞免疫熒光法鑒定細胞的純度。凝膠銀染方法鑒定寡聚體聚集情況。試驗分為正常對照組、激動劑組、拮抗劑組以及Aβ組激動劑+Aβ組、拮抗劑+Aβ組，用蛋白印跡法檢測α7nAChR蛋白表達情況以及激活細胞內(nèi)受體后對Aβ的降解作用。結(jié)果經(jīng)過傳代培養(yǎng)細胞得以純化。體外制備好的Aβ1～42除了含少量的未聚集的單體(4 kD)外，主要以二聚體、三聚體、九聚體等不同聚集形式的寡聚體存在。尼古丁組與對照組相比α7nAChR表達明顯升高(P<0.01)，尼古丁組與拮抗劑組相比α7nAChR表達升高(P<0.05)；收集的蛋白與上清液，尼古丁組與Aβ組相比Aβ的表達均明顯降低(P<0.01)，激動劑+Aβ組與拮抗劑+Aβ組相比Aβ的表達均明顯降低(P<0.01)。結(jié)論尼古丁可以激活星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的α7nAChR，激活的α7nAChR對Aβ具有明顯的降解作用，能夠為預(yù)防和治療阿爾茨海默氏病(AD)提供一個可能的方向。

〔關(guān)鍵詞〕尼古?。恍切文z質(zhì)細胞；α7乙酰膽堿能受體；阿爾茨海默??；β-淀粉樣蛋白；寡聚體

星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有維持內(nèi)平衡、防御、再生的基本作用。星形膠質(zhì)細胞功能降低會引起大腦的老化和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，例如阿爾茨海默病(AD)〔1〕。AD發(fā)病早期，發(fā)現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(Aβ)形成的老年斑周圍有持續(xù)、大量激活的星形膠質(zhì)細胞聚集。激活的星形膠質(zhì)細胞可產(chǎn)生多種炎癥因子，加劇Aβ的產(chǎn)生，導(dǎo)致神經(jīng)細胞的毒性損傷；同時，它可降解Aβ的毒性，降低Aβ對神經(jīng)細胞的損傷，并可通過結(jié)合、吞噬細胞外的Aβ，從而減少老年斑的聚集〔2〕。Aβ與尼古丁乙酰膽堿能受體(nAChR)也有密切聯(lián)系，通過濃度-效應(yīng)方式激活或抑制受體。α7nAChR具有受體保護功能，降低Aβ毒性；但是α7nAChR和Aβ、淀粉樣斑塊可導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變〔3〕。本文旨在研究α7nAChR是否對Aβ具有降解作用，為預(yù)防和治療AD提供一個可能的方向。

1材料與方法

1.1主要材料新生24 h的(Sprague-Dawley SD)大鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、F12無酚紅培養(yǎng)基購自Gibco公司(美國)；0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素購自Hyclone公司(美國)；GFAP兔抗牛多克隆抗體購自Dako公司(丹麥)；Cyb3標記的羊抗兔IgG購自碧云天公司；Aβ1～42肽、六氟異丙醇、DMSO、尼古丁購自Sigma公司(美國)；甲基牛扁亭購自TOCRIS公司(英國)；鼠抗Aβ多克隆抗體6E10購自Covance公司(美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠二抗購自Santa Cruz公司(美國)；一抗、二抗稀釋液、封閉液購自碧云天公司；預(yù)制膠、電泳槽、預(yù)染標準品、電泳液、銀染試劑盒等購自life technologies公司(美國)；濃縮管、聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus發(fā)光試劑購自Millipore公司(美國)；-80℃冰箱(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1體外制備Aβ參照Klein等〔4,5〕體外制備Aβ1～42寡聚體的方法，Aβ1～42粉末加入冷卻的六氟異丙醇，使粉末徹底溶解，終濃度為1 mmol/L，室溫孵育60 min后在冰上靜置5～10 min，轉(zhuǎn)移并等量分裝至離心管，通風(fēng)櫥室溫下過夜，使六氟異丙醇揮發(fā)完全。揮發(fā)完全后可見清晰透明的薄膜留在離心管底部。將干燥的肽膜存于-80℃冰箱。使用時將其放在冰上，用DMSO充分溶解，終濃度為5 mmol/L。接著用不含酚紅的F12培養(yǎng)基稀釋為100 μmol/L的濃度。4℃孵育24 h后，14 000 r/min冰凍高速離心機離心10 min，上清液即為寡聚體。

1.2.2寡聚體的鑒定選取4%～12%的Bis-Tris預(yù)制梯度膠，將制備好的Aβ寡聚體與不含還原劑的上樣緩沖劑混合后，70℃加熱10 min，加入預(yù)制膠的孔中電泳。結(jié)束后，使用銀染試劑盒，按照說明書要求，對膠進行染色，最后掃描凝膠。

1.2.3分組及細胞處理將培養(yǎng)好的星形膠質(zhì)細胞純化、傳代并鑒定后，以5×105ml的密度種入6孔板內(nèi)。根據(jù)實驗的要求，將細胞分為正常對照組、激動劑組、拮抗劑組以及Aβ組、激動劑+Aβ組、拮抗劑+Aβ組。其中正常對照組是正常的星形膠質(zhì)細胞，不加入任何干預(yù)手段；Aβ蛋白組是在培養(yǎng)的細胞內(nèi)加入終濃度為1 μmol/L的Aβ寡聚體；激動劑組為加入終濃度為5 μmol/L的激動劑尼古丁培養(yǎng)12 h；拮抗劑組為先加入濃度為10 μmol/L的α7nAchR拮抗劑甲基牛扁亭(MLA)2 h后，再加入激動劑尼古丁5 μmol/L培養(yǎng)12 h，激動劑+Aβ組加入濃度5 μmol/L的尼古丁培養(yǎng)12 h，換液，加入濃度1 μmol/L的Aβ寡聚體培養(yǎng)24 h；拮抗劑+Aβ組為先加入MLA培養(yǎng)2 h后，再加入尼古丁共同培養(yǎng)12 h，換液，最后加入濃度1 μmol/L的Aβ寡聚體培養(yǎng)24 h。37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4蛋白印跡法的檢測收集細胞的培養(yǎng)基后，加入濃縮管內(nèi)將培養(yǎng)基濃縮約100倍、冰凍離心機7 500 r/min 1 h后收集備用。接著用冰PBS清洗貼壁細胞后，加入裂解液，冰置2 h后，冰凍離心機14 000 r/min、20 min后提取上清即為細胞蛋白。分別將不同組別的培養(yǎng)基和細胞蛋白與上樣緩沖液混合后，70℃加熱10 min，選取4%～12%的Bis-Tris預(yù)制梯度膠，加入預(yù)制膠的孔內(nèi)，跑電泳。隨后將膠上的條帶轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，將膜封閉2 h。用稀釋后的α7nAChR、6E10一抗4℃孵育過夜后，再加入二抗在搖床上搖1 h。每進行下一步時，都要用含0.01%的吐溫-20的TBST清洗干凈。最后用ECL發(fā)光試劑觀察表達情況。

1.2.5結(jié)果分析用掃描儀掃描曝光膠片，ImageJ軟件分析結(jié)果時以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計算目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶總灰度的百分比值作為目的條帶蛋白的相對表達水平。分析培養(yǎng)基的結(jié)果時，以Aβ蛋白條帶作為內(nèi)參計算目的蛋白條帶與Aβ蛋白條帶總灰度的百分比值作為目的條帶蛋白的相對表達水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS21.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。

2結(jié)果

2.1星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及免疫熒光鑒定取24 h內(nèi)的SD乳鼠的大腦皮質(zhì)，培養(yǎng)7～9 d，純化并傳3～4代后，以GFAP細胞免疫熒光方法對星形膠質(zhì)細胞進行染色，在倒置顯微鏡下觀察，以Cy3標記陽性細胞呈紅色，細胞計數(shù)星形膠質(zhì)細胞占所有細胞的95%以上，可用于后續(xù)實驗，見圖1。

圖1　星形膠質(zhì)細胞GFAP細胞免疫熒光顯色(×400)

2.2Aβ寡聚體聚集情況結(jié)果按照銀染試劑盒的方法進行染膠。結(jié)果顯示有未聚合的單體(4 kD)，聚合好的Aβ寡聚體既含有低分子量的如二聚體、三聚體等，還有高分子量的如九聚體、十二聚體等不同聚集形式。見圖2。

1:Marker；2、3:不同分子量的Aβ 圖2 　Aβ1～42寡聚體的聚集情況

2.3蛋白印跡法檢測α7nAChR蛋白表達情況加入尼古丁的激動劑預(yù)處理組(137.33±17.67)與對照組(96.67±1.53)相比，α7nAChR蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；同時，激動劑組與加入拮抗劑MLA組(104.33±11.50)相比，α7nAChR蛋白表達水平升高(P<0.05)，說明尼古丁能夠激活星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的α7nAChR。見圖3。

圖3　加入尼古丁的α7nAChR蛋白表達情況

2.4蛋白印跡法檢測Aβ蛋白表達加入尼古丁，提取總蛋白后，尼古丁預(yù)處理組(53.67±8.14)與Aβ蛋白組(100±4.58)和拮抗劑預(yù)處理組(82±8.71)相比，尼古丁預(yù)處理組(63.67±8.50)的Aβ蛋白均明顯降低(P均<0.01)。收集培養(yǎng)基并回收濃縮后的上清液，尼古丁預(yù)處理組與Aβ蛋白組(180±12.77)和拮抗劑預(yù)處理組(93.33±6.51)相比，尼古丁預(yù)處理組的Aβ蛋白也有明顯降解的變化(P均<0.01)。見圖4。

A：提取總蛋白的Aβ蛋白表達情況；B：培養(yǎng)基上清液的Aβ蛋白表達情況圖4　尼古丁激活α7nAchR后Aβ蛋白表達情況

3討論

AD是最常見的癡呆類型，占60%～80%〔6，7〕。Aβ的聚集和沉積不僅可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡，也會破壞突觸結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致記憶和認知功能障礙〔8～12〕。

星形膠質(zhì)細胞是最多元化的膠質(zhì)細胞類型，參與維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)平衡〔13〕。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞有關(guān)。由此可推測，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)平衡中起著重要作用的星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)的一個關(guān)鍵因素〔14〕。在AD的大腦中發(fā)現(xiàn)增生的星形膠質(zhì)細胞聚集在老年斑周圍，說明內(nèi)生性老年斑可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞的聚集和激活。激活的星形膠質(zhì)細胞可產(chǎn)生多種炎癥因子會加劇Aβ的產(chǎn)生，導(dǎo)致神經(jīng)細胞的毒性損傷；同時，星形膠質(zhì)細胞能夠清除Aβ。星形膠質(zhì)細胞主要是通過兩種途徑清除Aβ，一種是通過細胞的吞噬功能；另一種則通過分泌降解Aβ的蛋白酶：神經(jīng)內(nèi)肽酶、胰島素降解酶(IDE)、基質(zhì)金屬蛋白酶和載脂蛋白E〔15，16〕。

膽堿能受體系統(tǒng)是體內(nèi)最重要、最經(jīng)典的神經(jīng)傳導(dǎo)通路之一。根據(jù)其藥理學(xué)特性，主要分為毒蕈堿型乙酰膽堿能受體(mAChRs)和nAChRs。這兩種受體類型和AD的發(fā)生都有密切聯(lián)系〔17〕。nAChRs屬于配體門控離子通道系統(tǒng)，響應(yīng)乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)合。nAChRs在整個腦內(nèi)分布廣泛，在大腦內(nèi)參與認知、記憶、學(xué)習(xí)等重要功能，還調(diào)節(jié)多種其他受體的功能，并具有抵抗細胞毒性的神經(jīng)保護作用〔18，19〕。nAChRs有α2～10和β2～4等12種亞單位，最主要的就是α4β2和α7nAChR，它們對于認知和記憶功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)突觸可塑性起著重要的作用〔20〕。研究表明Aβ能夠抑制α7nAChR的活力從而導(dǎo)致認知和記憶功能的降低〔21〕。在AD腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)Aβ與α7nAChR有高親和力，能夠損害這條信號通道。在Aβ毒性作用的誘導(dǎo)下，神經(jīng)細胞nAChR的易損性導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞及認知功能的障礙〔22〕。

尼古丁是煙草中主要的化學(xué)成分，能夠提高注意力、學(xué)習(xí)、記憶等認知功能，還涉及治療某些疾病，包括AD、帕金森病、精神分裂癥、焦慮、抑郁等〔23，24〕。尼古丁自身的α-螺旋結(jié)構(gòu)可與Aβ綁定，通過一個α-螺旋抑制β-折疊二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?淀粉樣蛋白，從而減慢淀粉樣蛋白聚集的過程。尼古丁還能夠分解預(yù)成型的淀粉樣纖維體。尼古丁激活α7nAChR，使α-分泌酶水解為淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)，這是一條不產(chǎn)生完整Aβ的代謝途徑，再由APP產(chǎn)生的較大N端片段sAPPα，可對神經(jīng)細胞產(chǎn)生營養(yǎng)和保護作用。同時，尼古丁使腦脊液中甲狀腺素運載蛋白升高，間接抑制毒性β-淀粉樣蛋白纖維體生成。甲狀腺素運載蛋白可約束Aβ，因此可以阻止Aβ聚集形成纖維體。尼古丁在自噬過程中也可促進細胞外Aβ內(nèi)在化和降解〔25〕。尼古丁作為N型膽堿能受體激動劑，能夠促進乙酰膽堿在突觸前的釋放。研究表明作為膽堿能受體激動劑的尼古丁能夠提高人類和實驗動物的認知功能〔26〕。

本實驗證實了尼古丁能夠激活星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的α7nAChR，星形膠質(zhì)細胞激活的α7nAChR可降解Aβ，為預(yù)防和治療AD提供了一個可能的方向。

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〔2015-12-06修回〕

(編輯李相軍)

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81260173)；教育部科學(xué)技術(shù)研究項目(2013032A)；貴州省科技廳國際合作項目(黔科合外G字〔2011〕7014號)；貴州省科技計劃(黔科合重大專項字〔2014〕6008號)

通訊作者：官志忠(1951-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子神經(jīng)病理學(xué)研究。

〔中圖分類號〕R361+.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3112-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.009

The activation of astrocytic α7 nicotinic receptor inhibit β-amyloid aggregation

KONG Xin, YU Wen-Feng, GUAN Zhi-Zhong.

The Department of Pathology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guangxi, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor(nAChR) of astrocytes of astrocytes were activated by nicotine, and the degradation effect of α7nAChR on β-amyloid.MethodsPrimary culture of rat astrocytes were prepared from the cortex and hippocampus of the brains of newborn Sprague-Dawley (SD) rats. Subculture for three or four times,the passaged cells were demonstrated purity by immunocytochemical stainings with anti-GFAP antibody. Aβ1～42oligomer was prepared by chemically synthetic Aβ1～42polypeptide in vitro and then the oligomers were identified by sliver staining.The experimental groups were divided into normal control, agonist, blocking agent, or(and) Aβ groups. The expression of α7nAChR protein and the degradation of Aβ after activation of astrocytic α7 nicotinic receptor were detected by Western blot.ResultsIn addition to discovery of several monomers, low molecular weight and high molecular weight in Aβ oligomers indicated the presence of dimer ,trimer and nonamer.Compared with that of control group, the expression of α7nAChR of Nicotine group was significantly higher (P<0.01), and the expression of α7nAChR of Nicotine group was higher than that of blocking agent group (P<0.05). Both culture medium and cell lysis, compared with those of Aβ group,the expressions of Aβin Nicotine group of were significantly lower(P<0.01),and they were significantly lower in Nicotine group than those of blocking agent group (P<0.01).ConclusionsNicotine could activate the α7nAChR in astrocytes and the activation of α7nAChR has a significant degradation effect on Aβ,which provides a possible direction for the prevention and treatment of AD.

【Key words】Nicotine; Astrocytes;α7nAChR; Alzheimer's disease; Amyloid β-protein; Oligomer

1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室

第一作者：孔欣(1988-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)病理學(xué)研究。