王　闖　王明娟　王一帆　齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北　承德　067000)

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宮頸鱗癌整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白的表達及生物學(xué)行為

王闖王明娟王一帆齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北承德067000)

〔摘要〕目的探討宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶(HPA)蛋白的表達及臨床意義。方法應(yīng)用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化方法(SP法)檢測68例宮頸鱗癌組織和20例宮頸正常組織整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶(HPA)蛋白表達情況，分析兩者在宮頸鱗癌組織中的表達相關(guān)性及生物學(xué)行為。結(jié)果宮頸鱗癌組織整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白的陽性表達率分別為77.9%和72.1%，均高于正常宮頸組織(P<0.05)；整合素α5β1、HPA蛋白均與宮頸鱗癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度顯著相關(guān)；整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=0.594)。 結(jié)論整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白高表達與宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，具有正協(xié)同作用，并可作為判斷宮頸鱗癌浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測因素。

〔關(guān)鍵詞〕宮頸鱗癌；整合素α5β1；乙酰肝素酶；組織芯片

宮頸鱗癌為女性常見的惡性腫瘤之一，目前臨床90%就診患者均處于進展期，即確診時已發(fā)生不同程度的局部浸潤或轉(zhuǎn)移。尋找宮頸鱗癌的早期診斷指標(biāo)和找到特異性作用途徑來抑制浸潤或轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成為研究的重點和熱點。整合素α5β1 主要通過調(diào)節(jié)細胞黏附和遷移,能顯著提高腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。乙酰肝素酶(HPA)能破壞細胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)促進腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移。所以作為細胞黏附分子的整合素α5β1以及能夠破壞ECM和BM的HPA在腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移過程中的作用非常重要〔1〕。目前國內(nèi)對宮頸鱗癌組織中整合素α5β1、HPA的相關(guān)性研究未見報道。本項目采用高通量、多樣本分析的組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化檢測的方法檢測宮頸鱗癌。

1資料與方法

1.1一般資料采集2011年8月至2014年4月，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、承德醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院及266醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理專家診斷確診為宮頸鱗癌組織68例，正常宮頸組織20例,平均年齡64歲。每例患者術(shù)前均未行各種激素治療及放療、化療。所有病例臨床病理資料完整，標(biāo)本均進行連續(xù)切片，片厚5 μm。

1.2實驗試劑整合素α5β1蛋白和HPA蛋白免疫組化試劑盒(北京Bioss生物技術(shù)有限公司)、0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示劑。

1.3組織芯片的構(gòu)建將需要的組織在HE切片上標(biāo)出，用組織芯片儀吸針從供體蠟塊取出組織，按照預(yù)先設(shè)計好的順序排列，裝載在受體蠟塊中，每例組織都可重復(fù)裝載，以保證芯片中組織的代表性，并且可避免組織脫片造成的信息丟失。受體蠟塊制備好后，連續(xù)5 μm切片粘貼于經(jīng)過APES處理過的玻片上。

1.4免疫組化采用免疫組化SP法同步檢測整合素α5β1和HPA蛋白的表達情況，一抗為小鼠抗整合素α5β1和HPA抗體。用PBS代替一抗作為陰性對照，由試劑公司提供陽性切片作為陽性對照。

1.5結(jié)果判定整合素α5β1蛋白表達主要分布于細胞質(zhì)和細胞膜，而HPA蛋白表達主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞。采用雙評分半定量法進行評分：靶細胞的陽性率<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；染色反應(yīng)的深度計分為0～3分，其中染色深度以多數(shù)細胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)，不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分。并根據(jù)這兩項的計分之和分為4級即：陰性(-)為0分，弱陽性(+)為1～2分，陽性()為3～4分。強陽性()為5～6分。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宮頸鱗癌和正常宮頸組織中的表達情況宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白陽性率明顯高于宮頸正常組織(P<0.05)。宮頸鱗癌組織中HPA蛋白的陽性率明顯高于宮頸正常組織(P<0.05)。見圖1，圖2，表1。

圖1　宮頸鱗癌及宮頸正常組織整合素α5β1蛋白的表達(DAB，×200)

圖2　宮頸鱗癌及宮頸正常組織HPA蛋白的表達(DAB，×200)

組織n染色結(jié)果-+陽性率(%)HPA染色結(jié)果-+陽性率(%)宮頸鱗癌組織68159172777.91)1911211772.11)癌旁正常組織201730015.01622020

與癌旁正常組織比較：1)P<0.05

2.2宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的臨床生物學(xué)行為關(guān)系 整合素α5β1和HPA蛋白在宮頸鱗癌非角化型組的表達都高于角化型組的表達，兩組間差異顯著(P<0.05)。臨床分期Ⅲ、Ⅳ期組整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表達都明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組，分期越高表達越強(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表達明顯都高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。浸潤深肌層組整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表達都明顯高于淺肌層組(P<0.05)。見表2。

表2　宮頸癌組織中整合素α5β1 和 HPA臨床生物學(xué)行為關(guān)系〔n(%)〕

2.3宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白和HPA蛋白表達的相關(guān)性68例宮頸鱗癌組織中α5β1蛋白和HPA蛋白表達強度呈明顯正相關(guān)(r=0.594，P<0.01)，即宮頸鱗癌組織中整合素α5β1表達愈強，HPA蛋白表達愈強，反之亦然，即：整合素α5β1和HPA在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有正協(xié)同作用。見表3。

表3　整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宮頸鱗癌組織中的相關(guān)性(n)

3討論

整合素α5β1是由α5和β1兩亞基結(jié)合而成的異二聚體。整合素α5β1是一類很重要的細胞表面受體，其配體是細胞外基質(zhì)蛋白的組成成分之一纖黏連蛋白(FN)，主要介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)、細胞與細胞間的黏附，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤、轉(zhuǎn)移過程中都起著重要作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)在許多惡性腫瘤組織中均有整合素α5β1的異常表達,整合素α5β1在胃癌〔3〕、肺癌〔4〕、肝癌〔5〕、腸癌〔6〕、膽囊癌〔7〕等腫瘤細胞中都有表達。遲福生等〔8〕研究賁門癌組織中整合素α5β1 mRNA的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)賁門癌組織中整合素α5β1 mRNA的表達明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，并且與癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期呈正相關(guān)，與癌組織分化程度呈負相關(guān)。李桃等〔3〕免疫組化方法檢測結(jié)果：整合素α5β1在胃癌中的表達明顯高于正常胃黏膜,這與本實驗結(jié)果相一致。整合素α5β1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達及意義的研究在國內(nèi)未見報道。本實驗采用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化SP法從蛋白水平上檢測整合素α5β1蛋白在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達情況,宮頸鱗癌的表達明顯高于宮頸正常組織，說明整合素α5β1蛋白與宮頸鱗癌發(fā)生有關(guān)。整合素α5β1蛋白與宮頸鱗癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有密切聯(lián)系，提示整合素α5β1蛋白參與了宮頸鱗癌的發(fā)生及浸潤、轉(zhuǎn)移過程。

完整的BM可以限制癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，癌細胞必須突破BM才能向遠處浸潤、轉(zhuǎn)移，因此能夠降解ECM及BM的物質(zhì)與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HPA是迄今為止人體內(nèi)的唯一能夠在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的酶，破壞ECM和BM促進腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移。HPA的正常表達僅限于胎盤和免疫器官，而在惡性腫瘤細胞中尤其在高侵襲力惡性腫瘤細胞中，都有HPA的異常高表達。蘇寧等〔9〕研究HPA在肝細胞癌及胃癌中的表達及其臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPA在肝細胞癌和胃癌中的過表達。姜維華等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)HPA在胃癌中高表達，且與腫瘤組織學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與本實驗結(jié)果相符。用組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)研究宮頸鱗癌未見報道。本實驗通過組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)檢測到HPA在宮頸鱗癌組織中過表達，和正常宮頸組織相比有明顯的差異，說明HPA在宮頸鱗癌的發(fā)生過程中有著非常重要的作用。HPA蛋白的表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及臨床分期都有關(guān)，這些也提示我們，HPA蛋白也參與了宮頸鱗癌浸潤、轉(zhuǎn)移的過程。

整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達的相關(guān)性未見報道，本實驗通過組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)結(jié)果顯示，整合素α5β1、HPA在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起著正協(xié)同作用。有理論認為〔11〕：可將腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移過程主要分成三步：黏附、降解和移動。整合素α5β1是一種黏附因子，它的過表達可以使得腫瘤細胞與BM、ECM間的黏附增高，而HPA人體內(nèi)的唯一能夠在特定部位裂解HSPG的酶，能夠降解ECM和BM，因此整合素α5β1的黏附作用和HPA的基質(zhì)降解作用在宮頸鱗癌的浸潤、轉(zhuǎn)移過程中是相互配合共同作用完成。

綜上，通過組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化同步檢測整合素α5β1、HPA蛋白在正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的表達情況，從而進一步說明整合素α5β1、HPA在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，并且二者起正協(xié)同作用，為探討宮頸鱗癌的浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，以及為宮頸鱗癌的早期診斷提供新線索，并且可以為宮頸鱗癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

4參考文獻

1金春亭.四種細胞黏附分子在老年宮頸癌浸潤中的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2007；27(18):1796-8.

2Giancotti FG,Ruoslahti E.Integrin signaling〔J〕.Science,1999;285(5430):1028-32.

3李桃，齊潔敏.整合素α5β1和乙酰肝素酶在胃癌中的表達及意義〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2012;33(19)：2974-6.

4韓其政，郭其森，賈慧，等.整合素α5β1與CD44s在非小細胞肺癌中表達的意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤學(xué)，2007;15(11)：1563-6.

5Su JM，Wang LY，Liang YL，etal.Role of cell adhesion signal molecules in hepatocellular carcinoma cell apoptosis〔J〕．World J Gastroenterol，2005;11(30)：4667-73．

6李智,李劍,萬相斌,等.E-cadherin 和整合素α5β1 的表達與結(jié)直腸癌生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系〔J〕.新醫(yī)學(xué),2011;42(4):227-30.

7王魯，蔡端，許祖德，等.粘附分子整合素α5β1在膽囊癌中的表達及其臨床意義〔J〕.中華實驗外科雜志，2000;17(1)：18-9.

8遲福生,王振元,王者生.賁門癌組織整合素α5β1mRNA表達及其臨床病理意義〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2010;17(10):752-4.

9蘇寧,陳斌,陳錦章,等.乙酰肝素酶在肝細胞癌及胃癌中的表達及其臨床意義〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志,2009;25(8):1207-9.

10姜維華,朱辛明,楊志平,等.乙酰肝素酶在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2011;31(17):3262-3.

11孫靖中，鄒雄.腫瘤分子生物學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998:312-8.

〔2014-12-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：河北省計生委指令性課題 (2012-A21)

通訊作者：齊潔敏(1966-)，女， 教授， 碩士生導(dǎo)師，主要從事生殖系統(tǒng)腫瘤研究。

〔中圖分類號〕R737.33

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3131-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.016

第一作者：王闖(1986-)，女，碩士，主要從事生殖系統(tǒng)腫瘤研究。