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(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，廣東　廣州　510260)

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雌激素缺乏條件下MiR-133通過調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化參與骨質(zhì)疏松形成的機制

謝楚海史群偉郭劍鴻范子文李菊根陳斌偉曹燕明吳波以

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，廣東廣州510260)

〔摘要〕目的探究MiR-133在雌激素缺乏條件下在骨質(zhì)疏松中的表達情況及對間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響。方法從絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者處分離間充質(zhì)干細胞，利用qRT-PCR檢測MiR-133的mRNA表達水平；利用熒光素酶和Western印跡檢測MiR-133對其靶基因SLC39A1表達的調(diào)控；通過檢測堿性磷酸酶和RUNX2表達情況，顯示MiR-133和SLC39A1對間充質(zhì)干細胞成骨分化產(chǎn)生的影響。結(jié)果MiR-133在雌激素缺乏的患者中顯著升高，并且負性調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化能力；MiR-133直接靶向負性調(diào)控SLC39A1啟動子活性，降低SLC39A1的蛋白表達水平；SLC39A1能夠上調(diào)堿性磷酸酶的活性，上調(diào)RUNX2的表達水平。結(jié)論MiR-133的過表達與雌激素缺乏具有顯著相關(guān)性，MiR-133通過抑制SLC39A1的表達弱化間充質(zhì)干細胞成骨分化能力，進而促使絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕MicroRNAs；間充質(zhì)干細胞；雌激素缺乏；骨質(zhì)疏松

絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松作為一種常見的骨科疾病，主要發(fā)病機制在于成骨細胞的骨重建和破骨細胞的骨吸收之間的平衡遭到了破壞〔1〕。骨吸收增多和骨重建不足與雌激素缺乏具有密切的相關(guān)性〔2，3〕。然而，對于雌激素缺乏在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中起到的具體機制現(xiàn)在還沒有明確報道。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是骨形成的重要來源。雌激素受體的缺乏可以對MSCs的分化產(chǎn)生影響〔4，5〕。但是，雌激素缺乏是如何調(diào)控MSCs向成骨細胞分化的機制尚處于未知領(lǐng)域。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道，miRNAs可能參與了間MSCs的分化過程，如miR-20增強了MSCs的成骨分化能力，而miR-141則具有相反的功能〔6～9〕。也存在幾種miRNAs，如 miR-503發(fā)生能夠異常調(diào)控在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松〔10〕，但是，其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的主要發(fā)生機制依舊沒有一個清楚的解釋結(jié)果。本實驗闡明MiR-133在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中的表達，并且直接靶向SLC39A1，從而弱化MSCs的成骨分化能力。

1材料與方法

1.1細胞與試劑人間充質(zhì)干細胞(hMSC)由本實驗室保存，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶購自研科生物公司；一抗及二抗購自武漢三鷹公司；細胞培養(yǎng)板購自Costar公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Pierce Chemical公司，5倍SDS蛋白上樣緩沖液、SDS、Tris、甘氨酸、TEMED、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、過硫酸銨、脫脂奶粉購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D-Hank緩沖液為自行配制。

1.2儀器倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；-80℃冰箱為中國海爾集團產(chǎn)品；板式酶標儀購自北京市新風(fēng)機電技術(shù)公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；單光子儀。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)將從絕經(jīng)患者體內(nèi)獲取的hMSC用含有15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化液消化細胞，并進行傳代，傳至4、5代左右，選取生長狀態(tài)良好、增殖旺盛的細胞用于試驗研究。

1.3.2建立穩(wěn)定干擾MiR-133的細胞系取對數(shù)生長期的細胞做實驗。在六孔板中種入生長狀態(tài)良好的細胞，當細胞密度達到50%～60%時進行轉(zhuǎn)染細胞，分3組：(1)hMSC細胞：常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；(2)anti-MiR-NC/hMSC細胞：瞬時轉(zhuǎn)染插入空載質(zhì)粒；(3)干擾MiR-133的hMSC細胞(anti-MiR-133)：瞬時轉(zhuǎn)染插MiR-133目標片段5′-GAAGTTTTATTCACATGCT-3′和 5′-CATCAGCTCTGATTCTGTG-3′。同時用脂質(zhì)體2000進行平行轉(zhuǎn)染，6 h以后換液，用G418進行篩選，利用Western印跡進行鑒定。

1.3.3MiR-133 SLC39A1 mRNA表達的檢測首先用TRIzol提取細胞總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，70℃ 10 min。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA 為模板，使用實時PCR檢測SLC39A1 mRNA 的相對表達量，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。內(nèi)參照為GAPDH。各引物序列：SLC39A1正向序列 5′-GTCACCTCTGGAGGAAACAAG-3′ 和反向序列5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′；GAPDH 正向序列5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′和反向序列5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′。實時PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39個循環(huán)。溶解曲線條件：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的Ct值(每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù))，通過2-△△Ct法計算樣品中多種mRNA 的相對表達量，所得產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.4熒光素酶活性檢測將hMSC細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至70%～85%融合度時，共轉(zhuǎn)染熒光素酶報告載體及negative control mimics，anti-MiR-NC和anti-MiR-133。以轉(zhuǎn)染pRL-TK作為標準內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細胞熒光素酶活性：棄去細胞培養(yǎng)液，PBS清洗3次，然后每孔加入已稀釋的1×PLB裂解細胞10 min。將細胞刮下，收集至1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心3 min，取上清。取25 μl上清，加入熒光素酶檢測試劑LARll 100 μl，記錄螢火蟲熒光素酶活性值；然后加入stop&Glo試劑100 μl，記錄海腎熒光素酶活性值。計算相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3.5成骨分化相關(guān)蛋白表達的檢測采用Western印跡法。

1.3.5.1蛋白樣品的獲得(1)蛋白裂解液的配制(100 μl體系)：100×蛋白酶抑制劑1 μl;蛋白裂解液加至100 μl。(2)蛋白抽提：用預(yù)冷的D-Hank液清洗3次，每一個孔加入蛋白裂解液，將其置于冰上裂解30 min，用細胞刮刀將孔中細胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，在4℃ 離心機中以12 000 r/min的速度離30 min，離心完畢后將其取出置于冰上，分裝備用。

1.3.5.2BCA法蛋白定量采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進行。

1.3.5.3蛋白變性按比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，置于金屬浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷卻，最后放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.4Western印跡分析(1)電泳：根據(jù)待檢測蛋白質(zhì)的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每泳道上樣40 μg，先70 V電泳30 min，再130 V電泳至溴酚藍染料跑出膠后停止電泳，冰上進行。(2)轉(zhuǎn)膜。(3)封閉：5%脫脂牛奶，用TBST稀釋，室溫封閉1 h。(4)一抗孵育：按照抗體說明書用TBST將一抗稀釋到適合的比例。 (5)洗膜：將PVDF膜轉(zhuǎn)入洗膜盒中，置于搖床上上下洗滌3次，每次10 min。(6)二抗孵育：根據(jù)實驗所用一抗的種屬選擇對應(yīng)的二抗，并用TBST將二抗稀釋到適合的比例，并將其置于搖床上室溫孵育1 h。(7)洗膜：將PVDF膜轉(zhuǎn)入洗膜盒中，加入適量的TBST液體，置于搖床上上下洗滌3次，每次10 min。(8)顯影：在膜表面滴入適量的HRP化學(xué)顯影液，使之覆蓋膜的整個表面，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1hMSC中MiR-133的表達情況絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的hMSC中MiR-133 mRNA的表達水平(3.09±0.79)比對照組(1.57±0.67)異常升高(P<0.05)。

2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾抑制MiR-133的hMSC細胞系的鑒定通過實時熒光定量檢測mRNA水平上，干擾效率達到80%以上，結(jié)果可信。正常未處理組、miR-NC組、anti-miR-133組分別為1.2±0.45,1.17±0.34，0.25±0.79。

2.3熒光素報告分析結(jié)果通過在線靶基因軟件預(yù)測，MiR-133可能與SLC39A1 mRNA的3′-UTR片段4 834～4 840 bp相結(jié)合，且該結(jié)合位點在多物種間高度保守。構(gòu)建報告載體后，通過熒光素活性檢測，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC組相比較，MiR-133能夠明顯抑制pSLC39A1-Mt報告載體的熒光素酶活性(P<0.05)，但是對突變型的pSLC39A1-Mut無明顯抑制作用；而轉(zhuǎn)染anti-MiR-133能夠明顯恢復(fù)pSLC39A1-Mt報告載體的活性；表明miR-133特異性與SLC39A1 mRNA的3′-UTR結(jié)合。見圖1。

與NC組比較：1)P<0.05圖1　miR-133對SLC39A1 mRNA 3′-UTR的調(diào)控情況

2.4利用已經(jīng)鑒定成功構(gòu)建的anti-MiR-133 hMSC細胞系進行恢復(fù)實驗當MiR-133過表達時SLC39A1和成骨分化的標志分子RUNX2的mRNA都發(fā)生顯著下降(P<0.05)，轉(zhuǎn)入anti-MiR-133 inhibitionor細胞和干擾細胞系中SLC39A1和RUNX2的mRNA水平有所恢復(fù)，與正常hMCSs沒有明顯差異。見圖2。

2.5利用已經(jīng)成功構(gòu)建的anti-MiR-133 hMSC細胞系進行恢復(fù)實驗當MiR-133過表達時，SLC39A1和成骨分化的標志分子RUNX2的蛋白表達水平(0.75±0.25，0.68±0.35)都發(fā)生顯著下降(miR-NC組分別為1.17±0.34，1.27±0.14，P<0.05)，轉(zhuǎn)入anti-MiR-133 inhibitionor細胞和干擾細胞系中SLC39A1和RUNX2的mRNA水平(1.25±0.79，1.15±0.29)有所恢復(fù)，與正常未處理組hMSCs(1.2±0.45，1.13±0.35)沒有明顯差異，見圖3。

A：正常未處理組；B：MiR-133組;C:anti-MiR-133組;D:anti-MiR-133 inhibitor組；1)P<0.05圖2　miR-133影響SLC39A1和RUNX2的mRNA表達水平

圖3　miR-133的變化對SLC39A1和RUNX2蛋白水平的影響

3討論

絕經(jīng)后婦女非常容易患骨質(zhì)疏松，在一定程度上是由于雌激素缺乏引起過度的骨吸收和骨形成不足〔11，12〕。然而，缺乏雌激素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的確切作用不太明顯。hMSCs具有分化為成骨細胞和骨細胞的能力，在骨代謝方面具有重要作用?，F(xiàn)有報道證明減少hMSCs分化為成骨細胞可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松〔13〕。最近的一些研究表示，在雌激素缺乏的情況下，microrNA會發(fā)生表達水平的異常性變化，而這些異常性變化可能會對參與成骨分化的hMSCs產(chǎn)生影響〔14，15〕。事實上，microRNA可以抑制或促進hMSCs成骨細胞的分化〔16〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，MiR-133在雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)處于一種高表達狀態(tài)，提示我們，MiR-133在雌激素缺乏的骨質(zhì)疏松中可能是作為一種癌基因在行使功能。我們進一步探究發(fā)現(xiàn)，MiR-133的沉默能夠明顯提高hMSCs成骨分化能力。通過熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，MiR-133特異性與SLC39A1 mRNA的3′-UTR結(jié)合，從而降低SLC39A1的轉(zhuǎn)錄活性，并且MiR-133能夠降低SLC39A1 mRNA表達水平，而且沉默MiR-133后SLC39A1和RUNX2表達升高，說明成骨分化進一步發(fā)生和加強。

綜上，雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松與Mir-133過表達有關(guān)。MiR-133可以通過削弱成骨分化誘導(dǎo)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生，至少部分是通過抑制SLC39A1表達，進一步抑制hMSCs成骨分化的發(fā)生，從而為雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的診治提供新的思路，有望成為雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松治療的新靶點。

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〔2015-12-06修回〕

(編輯李相軍)

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81574002)；廣東省自然科學(xué)基金項目(S2012010009190)

〔中圖分類號〕R605

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3105-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.006

MiR-133 is involved in estrogen deficiency induced osteoporosis by modulating osteogenic differentiation of mesenchymal stem cell

XIE Chu-Hai, SHI Qun-Wei, GUO Jian-Hong, et al.

Department of Orthopedics,the Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationships among MiR-133 (estrogen deficiency induced osteoporosis and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells).MethodsThe osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells ability of miR-133 on hMSC cells was detected by qRT-PCR. The binding between miR-133 and predicted target SLC39A1 were verified by dual luciferase assay and Western blot analysis. RUNX2 related proteins were detected using Western blot. ResultsmiR-133 expression was significantly enhanced as a result of estrogen deficiency. Its overexpression was negatively correlated to osteogenic differentiation of hMSCs. SLC39A1 showed an inverse expression trend to miR-133 during the differentiation. Western blot test showed osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells related proteins RUNX2 were obvious changed. ConclusionsmiR-133 overexpression is associated with estrogen deficiency. MiR-133 could induce postmenopausal osteoporosis by weakening osteogenic differentiation of hMSCs, at least partly through repressing SLC39A1 expression.

【Key words】MicroRNAs; Mesenchymal stromal cells; Estrogen deficiency; Osteoporosis

第一作者：謝楚海(1978-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨折及老年骨質(zhì)疏松研究。