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(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇　無錫　214000)

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阿托伐他汀對老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后細(xì)胞凋亡的影響

張?jiān)圃泣S玲玲王濱洪侃萬鶴鳴陸守榮丁新生1

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇無錫214000)

〔摘要〕目的探討阿托伐他汀對老齡大鼠永久局灶性胡須體覺皮層缺血后凋亡的影響及機(jī)制。方法45只老齡大鼠依隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、對照組(等量生理鹽水)、阿托伐他汀處理組(20 mg/kg)。對照組及阿托伐他汀組于顯微鏡下結(jié)扎大腦中動脈數(shù)根分支構(gòu)建局灶胡須體覺皮層缺血模型并于造模后0、6、24、48 h分別以生理鹽水及阿托伐他汀灌胃。造模后72 h應(yīng)用蘇木精-伊紅(HE)染色檢測腦組織形態(tài)學(xué)；流式細(xì)胞儀檢測各組缺血區(qū)周圍細(xì)胞凋亡及壞死率；免疫組織化學(xué)染色檢測缺血區(qū)周圍Caspase-3 及血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-1 的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，阿托伐他汀對老齡大鼠72 h后有抗凋亡作用，其機(jī)制可能與減少缺血區(qū)周圍Caspase-3表達(dá)有關(guān)。該劑量阿托伐他汀對缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)無明顯影響。結(jié)論阿托伐他汀可能通過減少老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h的Caspase-3表達(dá)起著較好的抗凋亡作用。

〔關(guān)鍵詞〕阿托伐他??；腦缺血；凋亡

流行病學(xué)調(diào)查顯示年齡超過55歲后，腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)每十年增加1倍，而且其神經(jīng)祖細(xì)胞及非成熟神經(jīng)元隨著年齡的增長逐漸增加。本研究探討阿托伐他汀對老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h凋亡及壞死影響及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器雄性SD大鼠20～22 月齡45只。阿托伐他汀輝瑞制藥公司。AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司。Caspase-3、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-1抗體購自Santa-Cruz公司。免疫組化試劑盒武漢博士德生物有限公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀美國BD公司。Leica 彩色圖像分析系統(tǒng)；GS-2010 手術(shù)顯微鏡(常州三能光學(xué)設(shè)備有限公司)；10-0帶線縫合針(上海醫(yī)菱醫(yī)療器械銷售公司)，多導(dǎo)生理記錄儀、TSD 激光多普勒探頭、激光多普勒血流儀(Biopac公司，美國)。

1.2模型制備大鼠麻醉后固定在手術(shù)臺上，切開顳部皮膚和肌肉，用手術(shù)電鉆開6～8 mm的顱窗，刺激對側(cè)胡須，激光多普勒血流儀測定刺激前后局部腦血流，確定體覺皮層支配血管后在顯微鏡下以10-0 手術(shù)線穿過硬腦膜，結(jié)扎胡須體覺皮層周圍數(shù)根大腦中動脈的分支，激光多普勒血流儀再次測定局部腦血流，同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)勁總動脈10 min。假手術(shù)組的大鼠麻醉后固定在手術(shù)臺上，切開顳部皮膚和肌肉，用手術(shù)電鉆開6～8 mm顱窗，不結(jié)扎大腦中動脈樹根分支〔1〕。

1.3大鼠分組45只老齡大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組及阿托伐他汀組，對照組及阿托伐他汀組予術(shù)后0、6、24、48 h以20 mg/kg生理鹽水及阿托伐他汀灌胃，72 h后處死各組大鼠。

1.4病理學(xué)觀察假手術(shù)組、對照組及阿托伐他汀組進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅( HE) 染色,光鏡下觀察腦缺血72 h后組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5流式細(xì)胞儀檢測缺血區(qū)凋亡各組大鼠處死于75%酒精浸泡1～3 min放置超凈工作臺，取出大腦缺血區(qū)及周圍組織并將其置于事先消毒好的200目篩網(wǎng),輕輕研磨腦組織，使其變成單個(gè)細(xì)胞，待研碎后用培養(yǎng)液沖洗，細(xì)胞篩下容器內(nèi)所盛溶液為單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞重懸于500 μl上樣緩沖液,加入5 μlAnnexinV-FITC 和5 μl PI,混勻后室溫避光反應(yīng)10 min，上機(jī)檢測。

1.6取材及切片制備72 h后各組分別取5只大鼠麻醉后打開腹腔，剪開肋骨，經(jīng)左心室插管至主動脈后快速依次灌注生理鹽水及4%多聚甲醛，斷頭取腦分離前囟前后1 mm腦組織浸入4%多聚甲醛固定6 h，蒸餾水漂洗，酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片5 張，片厚5 μm。

1.7免疫組化染色檢測缺血區(qū)周圍Caspase-3及VEGFR-1表達(dá)常規(guī)脫蠟至水，以Caspase-3、VEGFR-1抗體為一抗進(jìn)行操作，方法參照試劑盒說明書。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，封片鏡檢。PBS 代替Caspase-3、VEGFR-1抗作陰性對照。采用Leica計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對組織切片圖像分析，以細(xì)胞呈棕色或棕褐色為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片計(jì)算5個(gè)不重復(fù)的視野計(jì)數(shù)，取其平均值來作為Caspase-3、VEGFR-1的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS16.0軟件,行單因素方差分析，方差齊時(shí)進(jìn)一步采用LSD進(jìn)行兩兩比較。

2結(jié)果

2.1HE染色假手術(shù)組腦組織細(xì)胞正常，老齡大鼠腦缺血后72 h神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞變性，胞核溶解，可見較多細(xì)胞碎片。阿托伐他汀組老齡大鼠缺血后72 h神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞亦有水腫、變性壞死，但較模型組細(xì)胞稍完整(圖1)。

圖1　老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h病理學(xué)觀察(HE，×200)

2.2流式細(xì)胞儀檢測缺血區(qū)凋亡情況假手術(shù)組可見少量凋亡及壞死細(xì)胞，對照組及阿托伐他汀組的細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)假手術(shù)組均明顯增加，與對照組缺血72 h組相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h組的凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)明顯減少(表1)。

2.3免疫組化染色檢測缺血區(qū)周圍Caspase-3表達(dá)假手術(shù)組僅可見少量Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)，對照組及阿托伐他汀組的Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)假手術(shù)組均明顯增加，與對照組缺血72 h組相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h組的Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(圖2，表1)。

表1　各組老年大鼠凋亡及壞死率及Caspase-3、VEGFR-1陽性細(xì)胞數(shù)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01;與對照組比較：2)P<0.01

圖2　免疫組化染色檢測老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h的Caspase-3表達(dá)(DAB，×200)

2.4免疫組化染色檢測缺血區(qū)周圍VEGFR-1表達(dá)假手術(shù)組僅可見少量VEGFR-1陽性細(xì)胞數(shù)，對照組及阿托伐他汀組的VEGFR-1陽性細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)假手術(shù)組均明顯增加，與對照組缺血72 h相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h的VEGFR-1陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(圖3，表1)。

圖3　免疫組化染色檢測老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)(DAB，×200)

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀對老齡大鼠晚期凋亡有明顯保護(hù)作用，其與減少Caspase-3表達(dá)可能有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該劑量的阿托伐他汀對缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)無明顯影響。

腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的死亡包括缺血中心早期凋亡和半暗帶區(qū)的遲發(fā)性凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在生理狀態(tài)下的死亡過程，其有促進(jìn)和凋亡基因共同作用。Caspase家族是目前哺乳動物凋亡的主要啟動因子，其中Caspase-3是Caspase級聯(lián)瀑布下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶。正常情況下，Caspase-3參與細(xì)胞凋亡可以通過線粒體途徑和細(xì)胞表面受體途徑來發(fā)揮作用〔2〕。早期研究〔3〕表明在局灶性永久性腦缺血模型中,利用Northern印跡分析提示缺血側(cè)半球腦組織缺血后16～ 24 h,Caspase-3水平顯著增高。還有研究發(fā)現(xiàn)抑制Caspase-3的活化可以減輕以細(xì)胞凋亡為主要機(jī)制的缺血后遲發(fā)性細(xì)胞損害，增加存活神經(jīng)元數(shù)量，縮小腦梗死體積，并改善神經(jīng)功能〔4～6〕。

年齡對腦組織缺血后的凋亡及修復(fù)有著重要的影響，Davis 等〔7〕比較了成年和老齡大鼠腦組織梗死后梗死體積情況，提示老齡大鼠的梗死體積較成年大鼠體積增大，推測腦梗死的體積與增齡有關(guān)。李建生等〔8〕研究表明老齡大鼠腦缺血3 h和I/R12 h 腦梗死面積較青年大鼠增大，隨著I/R 時(shí)間延長,腦組織細(xì)胞損傷逐步加重,老齡大鼠較青年大鼠嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡隨著I/R 時(shí)間延長而明顯增加,老齡大鼠出現(xiàn)的早、持續(xù)時(shí)間長。本研究藥物對老齡大鼠胡須體覺皮層永久性腦缺血模型晚期凋亡及壞死率的保護(hù)作用更符合臨床中出現(xiàn)的病例特征。

研究發(fā)現(xiàn)腦組織軸突損傷后可以修復(fù)，但修復(fù)能力較弱，可能周圍微環(huán)境影響其修復(fù)過程〔9〕。腦缺血后神經(jīng)修復(fù)依賴于軸突的生長、準(zhǔn)確的投射及突觸的形成〔10〕，其過程不僅僅需要營養(yǎng)因子、生長因子等調(diào)控，與軸突生長抑制因子表達(dá)有著密切的關(guān)系〔11〕。VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞的分裂原，主要與細(xì)胞表面受體結(jié)合后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、加速新生血管形成〔12,13〕。VEGF同時(shí)能夠促進(jìn)軸突生長，對神經(jīng)起著直接營養(yǎng)的作用〔14〕。VEGFR包括：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR-3(Flk-4)及神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白(NP)-1和NP-2。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面主要是VEGFR-1與VEGFR-2，VEGFR-2主要是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化，VEGFR-1也參與該過程。VEGFR-1的胞外部分則比VEGFR-2對VEGF具有更高的親和力，能以可溶形式存在〔15〕。VEGF主要通過VEGFR-1與VEGFR-2在內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮作用〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)該劑量的阿托伐他汀對缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)無明顯影響，可能考慮與阿托伐他汀的劑量及作用時(shí)間有關(guān)。

他汀類藥物，即3-羥基3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一類強(qiáng)效降膽固醇藥物。既往研究表面阿托伐他汀鈣具有降低血脂、穩(wěn)定斑塊、預(yù)防卒中復(fù)發(fā)等作用〔17,18〕。阿托伐他汀可能通過上調(diào)eNOS挽救缺血周圍區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，通過增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)，而與血清膽固醇水平無關(guān)〔19～22〕。

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〔2014-12-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項(xiàng)目：無錫市科技計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(SCZ00N1102)；南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金面上項(xiàng)目(2011njmu023)

通訊作者：王濱(1960-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病及神經(jīng)變性病研究。

〔中圖分類號〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3128-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.015

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省人民醫(yī)院

第一作者：張?jiān)圃?(1985-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。