魏宏達(dá) 李 波，2，3* 魏 來 劉志平 姜春明 史迎秋 徐艷春，2，3*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040；3.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040；4.哈爾濱華隆藍(lán)狐育種有限公司，哈爾濱，150040)

貉(Nyctereutesprocyonoides)隸屬于食肉目(Carnivora)，犬科(Canidae)，犬亞科(Caninae)，貉屬，原產(chǎn)于東亞地區(qū)；20世紀(jì)初期作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物引入歐洲[1-2]。貉分為6個(gè)亞種：俄羅斯和中國(guó)東北的烏蘇里亞種(N.p.ussuriensis)、朝鮮半島亞種(N.p.koreensis)、中國(guó)南部和越南北部的指名亞種(N.p.procyonoides)、云南的滇北亞種(N.p.orestes)、北海道亞種(N.p.albus)、日本亞種(N.p.viverrin-us)[3-5]。我國(guó)20世紀(jì)70年代開始引入野生貉種群(烏蘇里亞種為主)開展規(guī)?；Z養(yǎng)繁殖[6]。1990年由野生型貉培育出白色型貉，命名為吉林白貉[7]；2006年山東臨沂飼養(yǎng)種群中出現(xiàn)了紅褐色型貉[8]。這豐富了養(yǎng)殖貉種群的色型，提升了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使其成為我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一。但經(jīng)過50年的人工飼養(yǎng)和繁育、無新野生個(gè)體引入、遺傳漂變等因素可能導(dǎo)致貉種群遺傳多樣性水平下降，近交衰退的幾率增加。為此有必要徹底調(diào)查養(yǎng)殖貉種群遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，溯源其母系起源，這有助于制定科學(xué)的遺傳管理方案，有利于養(yǎng)殖種群的可持續(xù)發(fā)展。

國(guó)內(nèi)對(duì)于貉種群遺傳學(xué)研究包括中國(guó)貉種群的亞種分類：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析結(jié)果表明中國(guó)貉分為4組：廣西、安徽、陜西、云南—越南[9]；線粒體DNA(mtDNA)限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果說明分布于華北和陜西的貉種群應(yīng)各自獨(dú)立為亞種[10]。研究還顯示貉毛色變化與多個(gè)基因的多態(tài)性、突變和表達(dá)相關(guān)：黑素皮質(zhì)素受體1(MC1R)、鼠灰色基因(Agouti)、白色基因(KIT)[11-13]。國(guó)際上研究了野生貉種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)：線粒體控制區(qū)(CR)分析表明俄羅斯貉種群可以劃分為2個(gè)mtDNA世系[14]；16個(gè)微衛(wèi)星分析結(jié)果說明歐亞大陸種群和日本島嶼種群間有顯著的遺傳分化，大陸種群可分為朝鮮半島南部、中國(guó)—俄羅斯、越南3個(gè)亞群，且其種群遺傳多樣性水平依次遞減[15]。基于細(xì)胞色素b(Cytb)基因的貉系統(tǒng)地理學(xué)研究說明該物種存在多個(gè)冰期避難所，韓國(guó)和日本貉種群間沒有發(fā)生基因交流[16]?？傊?，由于采集樣本難以全面覆蓋各地理種群，國(guó)內(nèi)貉種群的種下分類及與國(guó)外鄰近地區(qū)種群的關(guān)系還需進(jìn)一步分析。本研究利用非損傷性技術(shù)收集了東北和華北地區(qū)養(yǎng)殖種貉的毛樣，測(cè)定了其線粒體Cytb基因和CR部分序列；結(jié)合GenBank中已知的同源序列綜合分析了國(guó)內(nèi)貉養(yǎng)殖種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，揭示了其母系起源。

1 材料和方法

1.1 材料

利用非損傷性技術(shù)收集了黑龍江養(yǎng)殖場(chǎng)野生型貉102只、紅褐色型貉13只、白色型貉5只和河北養(yǎng)殖場(chǎng)野生型貉40只的毛樣本。采集毛樣品多數(shù)有毛囊，放入取樣袋中密封、-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

試驗(yàn)材料經(jīng)預(yù)處理后利用蛋白酶K消化，后用基因組提取試劑盒(上海百賽生物工程技術(shù)有限公司)提取和純化總DNA。利用引物L(fēng)14724/H15915[16]和NycDLF0/NycDLR01[14]分別擴(kuò)增貉線粒體Cytb基因和CR部分序列。PCR反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行，包括2×EasyTaqSuperMix(Transgen，北京)25 μL，正、反向引物(10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌去離子水 18 μL。擴(kuò)增采用PE9700型和2400型DNA擴(kuò)增儀(PE，美國(guó))，PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，44℃/58.5℃(Cytb/CR)退火45 s，72℃延伸90 s/60 s(Cytb/CR)，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min/5 min(Cytb/CR)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(220 v/25 min)。電泳后將PCR產(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物科技有限公司，利用原擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

從GenBank下載66條同源序列：烏蘇里亞種CR序列30條(JF809819-JF809848)，烏蘇里亞種Cytb基因5條(JX099862-JX099866)，朝鮮半島亞種Cytb基因8條(JX099854-JX099861)，日本亞種Cytb基因17條(JX099869-JX099870、JX099872-JX099880、JX09 9884-JX099889)，北海道亞種Cytb基因4條(JX09 9871、JX099881-JX099883)，指名亞種Cytb基因2條(JX099867、JX099868)。將實(shí)驗(yàn)所得Cytb基因和CR序列峰圖導(dǎo)入DNAstar軟件包的Seqman程序進(jìn)行拼接，對(duì)內(nèi)部位點(diǎn)進(jìn)行人工校對(duì)，并與下載的貉同源序列進(jìn)行對(duì)比確定變異位點(diǎn)。利用MEGA 5.2.1[17]軟件計(jì)算Cytb基因和CR序列的堿基組成。利用DNAsp 6[18]軟件分析確定單倍型、計(jì)算單倍型數(shù)(haplotype number，H)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)以及平均核苷酸差異(average number of nucleotide differences，K)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(number of polymorphic sites，S)等數(shù)據(jù)。

選用最大似然法(maximum likelihood，ML)和貝葉斯推論法(Bayesian inference，BI)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。在MEGA 5.2.軟件中計(jì)算核苷酸最佳替代模型，并根據(jù)貝葉斯信息準(zhǔn)則(Bayesian information criterion，BIC)選擇最佳模型——Hasegawa-Kishino-Yano+G(HKY+G)[19]。利用IQ-TREE構(gòu)建ML樹[20]，自舉檢驗(yàn)值(bootstrap，BS)由1 000次重復(fù)檢驗(yàn)獲得；使用軟件MrBayes 3.2.1[21]構(gòu)建貝葉斯樹，主要參數(shù)包括：將馬爾可夫鏈運(yùn)行2 000 000代，每100代記錄1次樹，舍棄最先生成的25%樹，由后驗(yàn)概率(posterior probabilities，PP)評(píng)價(jià)其置信度。2種樹都以北極狐線粒體基因組中的同源序列作為外群(序列號(hào)NC_026529)。

2 結(jié)果

2.1 序列特征和單倍型

實(shí)驗(yàn)測(cè)得158條Cytb基因序列(1 140 bp)。平均堿基組成：29.58% A、13.75% G、28.64% C、28.03% T，A+T含量(57.61%)高于C+G含量(42.39%)。在1 140 bp中包含15個(gè)變異位點(diǎn)(1.36%)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)13個(gè)，單突變位點(diǎn)2個(gè)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得145條CR序列(659 bp)。平均堿基組成：26.93% A、17.29% G、27.39% C、28.39% T，A+T含量(55.32%)高于C+G含量(44.68%)。在659 bp中包含19個(gè)變異位點(diǎn)(2.88%)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)17個(gè)，單突變位點(diǎn)2個(gè)。

158條Cytb基因序列定義了5個(gè)單倍型，其中有3個(gè)與俄羅斯產(chǎn)烏蘇里亞種共享單倍型(CH1、CH2、CH3)，2個(gè)新單倍型(CH4、CH5)。養(yǎng)殖種群優(yōu)勢(shì)單倍型為CH1(48.73%)。145條CR序列定義了6個(gè)單倍型，其中有4個(gè)與俄羅斯產(chǎn)烏蘇里亞種共享單倍型(DH1、DH2、DH3、DH4)，2個(gè)新單倍型(DH5、DH6)。種群優(yōu)勢(shì)單倍型為DH1(67.59%)，單倍型CH5-DH5來自黑龍江養(yǎng)殖場(chǎng)。

2.2 種群遺傳多樣性

貉亞種種群及我國(guó)養(yǎng)殖種群Cytb基因核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等信息見表1。養(yǎng)殖種群的單倍型多樣性為(0.637±0.020)，核苷酸多樣性為(0.523±0.009)%，平均核苷酸差異為5.96。國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖貉種群Cytb基因核苷酸多樣性和平均核苷酸差異均略低于產(chǎn)于俄羅斯的烏蘇里亞種野生種群(0.596%和6.800)，高于其他4個(gè)亞種的野生種群。

表1 貉Cyt b基因的遺傳多樣性參數(shù)

俄羅斯烏蘇里貉野生種群及我國(guó)養(yǎng)殖種群CR單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等信息見表2。國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖種群?jiǎn)伪缎投鄻有詾?0.500±0.042)，核苷酸多樣性為(0.982±0.071)%，平均核苷酸差異為6.46。我國(guó)東北與華北地區(qū)的貉養(yǎng)殖種群遺傳多樣性水平一致，但都明顯低于同亞種的俄羅斯野生種群。

表2 貉CR序列的遺傳多樣性參數(shù)

國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的野生型、白色型和紅褐色型貉種群?jiǎn)伪缎投鄻有?Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等信息見表3。Cytb基因和CR序列2種分子標(biāo)記分析結(jié)果都表明白色型遺傳多樣性水平略高于野生型，這應(yīng)與白色型樣本量偏小有關(guān)。紅褐色型貉單倍型多樣性和核苷酸多樣性都顯著低于野生型貉，涉及的Cytb基因和CR序列單倍型各自均只有2個(gè)，優(yōu)勢(shì)單倍型為HC2-DH2(92.30%)。這說明紅褐色型貉主要是單一單倍型的毛色基因突變而來。

表3 野生型、白色型和紅褐色型貉種群遺傳多樣性參數(shù)

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

基于Cytb基因和CR序列單倍型構(gòu)建最大似然樹(ML)及貝葉斯樹(BI)，除置信度不同，2種樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相同(圖1，圖2)。基于Cytb基因的系統(tǒng)發(fā)育樹說明東北亞地區(qū)分布的野生貉種群可分化為4個(gè)mtDNA世系：越南的指名亞種為世系1；日本亞種與北海道亞種獨(dú)自組成世系2，與大陸種群(烏蘇里亞種、朝鮮半島亞種、指名亞種)差異明顯；7個(gè)朝鮮半島亞種單倍型與4個(gè)烏蘇里亞種單倍型組成世系3；1個(gè)朝鮮半島亞種單倍型與2個(gè)烏蘇里亞種單倍型組成世系4。這說明朝鮮半島亞種與烏蘇里亞種有緊密的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖貉種群有4個(gè)Cytb基因單倍型均勻分布與3、4世系，與俄羅斯產(chǎn)烏蘇里貉有緊密的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，還有1個(gè)單倍型(CH5)分布于1世系，與越南產(chǎn)指名亞種有更近的親緣關(guān)系?；贑R序列的系統(tǒng)發(fā)育樹表明俄羅斯烏蘇里貉野生種群和國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖種群可分為A、B、C 3個(gè)mtDNA世系，B與C世系有更近的親緣關(guān)系。A世系(BS=67%，PP=51)包含2個(gè)共享優(yōu)勢(shì)單倍型(DH1和DH4，頻率62.87%)，B世系(BS=37%，PP=71)僅有單倍型DH5，C世系(BS=96%，PP=82)含有2個(gè)共享單倍型(DH2和DH3)和1個(gè)新單倍型(DH6)。由于單倍型CH5與DH5來自同一個(gè)體，這說明Cytb基因和CR序列得出的國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖貉種群遺傳結(jié)構(gòu)已一致。同時(shí)，也表明國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的貉種群多數(shù)屬于烏蘇里亞種，極少數(shù)個(gè)體屬于指名亞種。

3 討論

遺傳變異的程度反映物種進(jìn)化潛力的大小，決定了物種的生存能力[22-23]。本研究利用線粒體Cytb基因和CR序列評(píng)估國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖貉種群遺傳多樣性水平。結(jié)果顯示，盡管養(yǎng)殖貉種群Cytb基因遺傳多樣性水平與俄羅斯同亞種的相近，但CR區(qū)上顯著低于后者。這與2種分子標(biāo)記的進(jìn)化速率不同有關(guān)：Cytb基因進(jìn)化速率適中，適合研究種內(nèi)、種間、科間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[24]；CR區(qū)因選擇壓力小而進(jìn)化速率快，適合研究親緣關(guān)系較近的群體[25]。因而，CR區(qū)的分析結(jié)果更能體現(xiàn)養(yǎng)殖貉種群遺傳多樣性的真實(shí)水平。Grant等[26]利用單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)評(píng)估種群遺傳多樣性水平高低的臨界值分別是0.5和0.5%。該標(biāo)準(zhǔn)也被用于研究哺乳動(dòng)物種群遺傳多樣性，例如鵝喉羚(Gazellasubgutturosa)[24]、淮南豬(Susscrofa)[27]。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖貉種群?jiǎn)伪缎投鄻有蕴幱谂R界點(diǎn)、核苷酸多樣性處于較高水平。這種遺傳多樣性模式可能主要是由奠基者效應(yīng)導(dǎo)致的。養(yǎng)殖貉種群建群時(shí)個(gè)體數(shù)偏少，缺乏遺傳管理的繁殖模式促使原來有限的單倍型丟失的風(fēng)險(xiǎn)增加，但遺傳漂變?cè)斐珊塑账岫鄻有詠G失要緩慢得多。同時(shí)，以生產(chǎn)性能作為單一選育指標(biāo)的繁殖模式作用下，種群內(nèi)會(huì)不可避免地發(fā)生近交，從而造成遺傳多樣性的丟失和個(gè)體適合度下降[28-29]。

紅褐色型貉遺傳多樣性水平顯著低于其他2種色型，涉及的優(yōu)勢(shì)單倍型為CH2-DH2。這與該色型產(chǎn)生模式——由毛色基因突變獲得新色型，依賴近親繁殖擴(kuò)繁種群數(shù)量[8，30]是一致的。白色型貉種群遺傳多樣性水平略高于野生型貉，可能是因?yàn)槿哟嬖谄睢４送?，吉林白貉的色型為雜合顯性，近親交配會(huì)出現(xiàn)基因純合致死現(xiàn)象[31]也是不容忽視的因素。因此，為維持養(yǎng)殖貉種群的質(zhì)量，建議在保證生產(chǎn)性能的基礎(chǔ)上將遺傳多樣性變化引入種群遺傳管理中。當(dāng)種群遺傳多樣性和近交衰退達(dá)到臨界值時(shí)考慮引入具有新基因型的野生貉改良現(xiàn)有種群。

單倍型分析顯示，國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖貉種群與俄羅斯野生種群間存在3個(gè)Cytb基因和4個(gè)CR序列優(yōu)勢(shì)共享單倍型，這說明二者同為烏蘇里亞種[32]、種群間有緊密的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。野生貉種群易受環(huán)境因素限制，活動(dòng)范圍較小[33]。本研究還發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖種群的Cytb基因單倍型CH5與越南產(chǎn)的貉指名亞種單倍型親緣關(guān)系較近。這表明早期建群引種過程中可能偶然引入了華南地區(qū)分布的指名亞種?；贑ytb基因和CR序列系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析得出了相同的結(jié)果，即養(yǎng)殖貉種群來自3個(gè)mtDNA世系。部分世系劃分的置信度偏低，這與選取的線粒體序列片段較小有關(guān)，增加片段長(zhǎng)度可能會(huì)提高置信度[34]。相較于俄羅斯的烏蘇里貉，國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖貉種群建群時(shí)個(gè)體的涵蓋度較廣，不同世系個(gè)體的交配繁殖，會(huì)有效抑制近交衰退的效應(yīng)。

綜上分析，我國(guó)養(yǎng)殖貉種群遺傳基礎(chǔ)較好，但明顯低于俄羅斯野生烏蘇里貉種群，且已經(jīng)出現(xiàn)遺傳多樣性下降的跡象。需要監(jiān)控種群遺傳多樣性的變化，引入具有新基因型的野生貉種，制定科學(xué)的交配模式，避免近交衰退。