陳曉寧 封 托 侯 祥 安曉雷 王 京 常 罡

(陜西省動(dòng)物研究所，西安，710032)

羅氏鼢鼠(Myospalaxrothschildi)主要生存在我國(guó)西北地區(qū)，其環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，嚴(yán)重?fù)p害農(nóng)林牧的水土保持[1]。調(diào)查顯示，成年羅氏鼢鼠的身長(zhǎng)通常為150—215 mm，體重為114—365 g。體型較其他鼢鼠偏小。四肢短而粗壯，有尖銳的爪子。前腳爪更發(fā)達(dá)，像鐮刀一樣向外彎曲。羅氏鼢鼠每天進(jìn)食時(shí)間較長(zhǎng)，不冬眠，常年在地下挖洞尋找食物。羅氏鼢鼠主要傷害幼樹，吃掉幼樹的根，引起禿頂并導(dǎo)致死亡[2]。

在中國(guó)天然藥庫的陜西省鎮(zhèn)巴縣，鼢鼠危害問題逐年加劇。該地區(qū)主要害鼠為羅氏鼢鼠[3]。例如根據(jù)作者的調(diào)查，在鎮(zhèn)巴縣內(nèi)涇洋鎮(zhèn)的建邑種植場(chǎng)，每年約50%的藥材植株被羅氏鼢鼠損壞，對(duì)當(dāng)?shù)孛撠氈赂还ぷ髟斐闪擞绊憽Ｒ虼?，有必要研究?dāng)?shù)亓_氏鼢鼠與特殊環(huán)境因素的相互關(guān)系。

腸道內(nèi)容物的微生物種群結(jié)構(gòu)與嚙齒類動(dòng)物種類有密切關(guān)系，可以反映出環(huán)境對(duì)嚙齒動(dòng)物的相互作用，確認(rèn)其在生態(tài)系統(tǒng)中的位置，對(duì)于鼠害防控具有重要指導(dǎo)意義[4]。嚙齒動(dòng)物腸道內(nèi)容物中的微生物的種類功能與宿主的生理狀態(tài)組成動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)，與宿主的新陳代謝也有緊密聯(lián)系。有研究顯示，嚙齒類動(dòng)物的不同腸道段內(nèi)微生物在門水平上以分解利用植物的種類為優(yōu)勢(shì)種群(厚壁菌門Firmicutes 和擬桿菌門Bacteroidetes)，占比達(dá)89%。十二指腸與其他腸道的微生物比例差異較大，而盲腸中厚壁菌門更多[5]。腸道微生物可以幫助嚙齒類動(dòng)物應(yīng)對(duì)植物次生代謝物的有毒成分，通過研究沙漠林鼠(Neotomalepida)腸道微生物的穩(wěn)態(tài)，發(fā)現(xiàn)腸道微生物能協(xié)助宿主適應(yīng)植物性食物中的有毒成分，拓展了宿主的飲食生態(tài)位。對(duì)小林姬鼠(Apodemussylvaticus)腸道微生物16S RNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)隨著季節(jié)變化，乳桿菌屬(Lactobacillus)微生物比例下降，另枝菌屬(Alistipes)，螺桿菌屬(Helicobacter)比例升高，相應(yīng)的宿主食物由蟲子轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锓N子[6]。分析高原鼠兔的腸道內(nèi)容物發(fā)現(xiàn)微生物組成越復(fù)雜，微生物系統(tǒng)穩(wěn)定性越好[7]。一方面，優(yōu)勢(shì)種群的腸道細(xì)菌會(huì)影響宿主的很多生理反應(yīng)[8]；另一方面，宿主的物種屬性、生存狀態(tài)、食物組成和胃腸道生理結(jié)構(gòu)反過來會(huì)調(diào)節(jié)腸道微生物的群落和組成。這種關(guān)系對(duì)宿主很重要[9-10]。晝夜的變化也會(huì)對(duì)嚙齒類動(dòng)物腸道微生物數(shù)量造成影響，大多數(shù)白天處于休眠狀態(tài)，腸道乳桿菌含量較高，有利于胃腸蠕動(dòng)，機(jī)體解毒，感知環(huán)境。而在夜間，厚壁菌和擬桿菌數(shù)量增加，能量代謝與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育水平增強(qiáng)。對(duì)特定光暗循環(huán)期間收集的小鼠糞便進(jìn)行宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，某些腸道基因組數(shù)量差異較大，表明存在特定時(shí)間段微生物功能群[11]。有研究顯示，小型哺乳類動(dòng)物的腸道菌群通過調(diào)節(jié)宿主的能量代謝來影響宿主的社會(huì)性行為[12]，有可能通過調(diào)控腸道微生物多樣性來影響嚙齒類動(dòng)物的覓食與繁殖行為。嚙齒動(dòng)物的性別與飲食結(jié)構(gòu)差異也會(huì)影響到腸道微生物多樣性，雌性鼢鼠的腸道微生物群落組成很接近，而雄性鼢鼠的腸道微生物多樣性比較復(fù)雜[5]。近年來，使用不育餌料對(duì)鼠害控制取得一定進(jìn)展[13]。研究羅氏鼢鼠腸道微生物的多樣性，可能幫助我們進(jìn)一步理解羅氏鼢鼠與特定環(huán)境適應(yīng)的機(jī)制。

現(xiàn)有研究多利用微生物分離與培養(yǎng)、克隆文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)方法探索腸道細(xì)菌多樣性[14-16]。但是，這些方法也有一定缺陷，可能會(huì)遺漏某些腸道微生物的種類。腸道內(nèi)容的微生物本身就具有復(fù)雜的多樣性，而且有些菌種還依賴厭氧環(huán)境。隨著檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展，為了克服傳統(tǒng)針對(duì)微生物鑒定與分析方法的缺點(diǎn)，新一代的高通量測(cè)序技術(shù)廣受關(guān)注和利用[17]，由于腸道微生物基因結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)非常適合該技術(shù)的使用，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)促進(jìn)了腸道內(nèi)容物中微生物多樣性分析的深度和廣度。研究羅氏鼢鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)鼠害防治將有重要參考價(jià)值。

本研究針對(duì)陜西省鎮(zhèn)巴縣中草藥種植區(qū)的羅氏鼢鼠樣品，采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，分析雌性羅氏鼢鼠腸道細(xì)菌多樣性，探究該地區(qū)羅氏鼢鼠腸道細(xì)菌對(duì)宿主食物資源的參與模式，并對(duì)菌群對(duì)宿主代謝功能的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為防治羅氏鼢鼠提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與保存

3只羅氏鼢鼠活體捕捉自陜西鎮(zhèn)巴縣大池鎮(zhèn)(海拔：823 m；地理位置：32°23′N，107°36′E；年均氣溫：13.8℃)，性別均為成年雌性，體重為(172.22±17.91)g(mean±SD)。在野外臨時(shí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將活體樣本經(jīng)過戊巴比妥鈉(質(zhì)量濃度1%)麻醉，在無菌環(huán)境下實(shí)施解剖，解剖羅氏鼢鼠的盲腸，收集內(nèi)容物，用滅菌凍存管保存待用，利用液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 腸道微生物 DNA 的提取

使用無菌藥勺在超凈工作臺(tái)里從收集的每個(gè)羅氏鼢鼠的盲腸內(nèi)容物凍存管里取100—150 mg樣本，用干冰快遞送至華大基因公司做DNA的提取與分析。DNA提取基本流程是加液氮研磨，DNA試劑盒提取細(xì)菌總DNA(QIAGEN，德國(guó))[18]。提取的DNA利用NanoDrop和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)以及完整性檢測(cè)，合格的樣品進(jìn)行測(cè)序。

使用TIANamp Stool DNA Kit(TIANGEN，China)對(duì)羅氏鼢鼠的盲腸內(nèi)容物總基因組DNA進(jìn)行提取，具體步驟見試劑盒說明書。使用通用引物338F-806R(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′)對(duì)16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系如下：模板DNA 10 ng，5×FastPfu緩沖液4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，正反引物(5 μmol/L)均為0.8 μL，添加ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系。然后使用以下條件擴(kuò)增DNA：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，循環(huán)25次；72℃ 10 min。在Illumina MiSeq平臺(tái)上對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(華大基因)。

1.3 生物信息學(xué)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)過濾，剩余高質(zhì)量的clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成tags；將tags聚類成OTU并與數(shù)據(jù)庫比對(duì)、物種注釋；基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析，以及關(guān)聯(lián)分析與模型預(yù)測(cè)等[19]。α多樣性指數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即單因素方差分析和LSD分析。

使用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)菌群的功能[20]。PICRUSt 軟件備份了greengene ID 對(duì)應(yīng)的KO(KEEG Orthology，KEGG 直系同源)信息。PICRUSt 首先標(biāo)準(zhǔn)化OTU 豐度表，即去除16S 標(biāo)記基因?qū)悠坊蚪M中的拷貝數(shù)的影響。然后通過每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的GreenGene ID，獲得OTU對(duì)應(yīng)的KO，并通過KO對(duì)應(yīng)的OTU豐度總和計(jì)算該KO的豐度。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的信息和OTU豐度信息計(jì)算各功能類別的豐度。此外，針對(duì)Pathway，運(yùn)用PICRUSt 分析代謝通路的信息，并分別得到豐度表。PICRUSt軟件備份了GreenGene ID 對(duì)應(yīng)的 COG(clusters of orthologous groups of proteins，直系同源序列聚類)信息。因?yàn)椴煌N屬菌種的16S拷貝數(shù)不相同，PICRUSt首先標(biāo)準(zhǔn)化16S測(cè)序數(shù)據(jù)的種屬數(shù)量。然后，16S的種屬信息比對(duì)數(shù)據(jù)庫中的功能基因，產(chǎn)生預(yù)測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道微生物多樣性

通過對(duì)羅氏鼢鼠腸道內(nèi)容物樣品測(cè)序得到Tag數(shù)據(jù)量有50 000個(gè)。從α多樣性指數(shù)分析結(jié)果(圖1，Chao1指數(shù))看出不同樣品的羅氏鼢鼠腸道內(nèi)容物菌群多樣性有一定差異。對(duì)羅氏鼢鼠樣品α多樣性指數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表1)，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)在樣本1和2，及樣本1和3之間有顯著性差異，而樣本2和3之間無顯著性差異。顯示樣品1的腸道菌落多樣性要高于樣本2和樣本3。

表1 羅氏鼢鼠腸道樣品ɑ多樣性指數(shù)LSD分析表

2.2 分析羅氏鼢鼠的腸道菌群的物種組成

從圖2可以看出，OTUs稀釋曲線隨著測(cè)量深度的增加而趨于平坦，說明測(cè)量數(shù)據(jù)量比較合理。通過曲線的曲率判斷出測(cè)序的結(jié)果較為完整，所測(cè)的數(shù)據(jù)量可以包含腸道內(nèi)容物所有微生物成分。但樣品3的測(cè)序深度可能不夠，多樣性指數(shù)曲線還在增長(zhǎng)，還沒有到飽和期。樣品3的稀釋曲線相對(duì)另2個(gè)樣品斜率較大，可能是由于腸道樣品采取位置不同影響的，需要進(jìn)一步調(diào)整測(cè)序方法，提高文庫覆蓋度。

OTU序列分類的結(jié)果(相似度設(shè)置為97%)顯示羅氏鼢鼠的腸道細(xì)菌隸屬10門9綱11目13屬。主要由放線菌門(Actinobacteria)(3.9%±4.2%)、變形菌門(Proteobacteria)(29.8%±37.9%)、擬桿菌門(31.4%±19.7%)、厚壁菌門(33.8%±15.3%)、柔膜菌門(Tenericutes)(0.06%±0.04%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)(0.007%±0.006%)、螺旋體菌門(Spirochaetes)(0.59%±0.65%)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)(0.09%±0.13%)、候選門輻射類群(TM7)(0.39%±0.31%)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)(0.003%±0.004%)等組成。通過圖3的結(jié)果反映出，革蘭氏陰性菌的變形菌門和革蘭氏陽性菌的厚壁菌門的菌類在總體上(門級(jí)別)及擬桿菌門，是羅氏鼢鼠盲腸中的優(yōu)勢(shì)菌群。從圖4可以看出，樣品3中埃希氏桿菌屬(Escherichia)以及梭桿菌屬(Clostridium)豐度較高，樣品1和2中革蘭氏陽性厭氧的瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和顫螺旋菌屬(Oscillospira)是次一級(jí)分類水平的優(yōu)勢(shì)群落(屬級(jí)別)。樣品3微生物豐度與另外2個(gè)樣品有差別，可能是樣品收集位置差異的影響。對(duì)比盲腸，嚙齒類動(dòng)物十二指腸內(nèi)變形菌門的細(xì)菌豐度會(huì)增加，而厚壁菌門豐度相對(duì)較少[21]。圖5為腸道細(xì)菌豐度熱圖，3個(gè)樣品差別不大。羅氏鼢鼠腸道微環(huán)境內(nèi)的微生物多樣性及豐度的差別有必要進(jìn)作一步的研究。

2.3 功能預(yù)測(cè)

PICRUSt軟件廣泛用于功能基因研究，并將菌群多樣性與宿主代謝情況聯(lián)系起來。經(jīng)過分析，羅氏鼢鼠腸道細(xì)菌的很多基因與代謝相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)有與聚酮類化合物和萜類化合物代謝相關(guān)的基因(圖6)。KEGG通路分析預(yù)測(cè)出很多基本代謝功能基因，主要涉及神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、萜類和聚酮類化合物的代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、外源性生物降解與代謝、遺傳信息處理、核苷酸代謝、輔助因子和維生素的代謝等。利用COG數(shù)據(jù)庫比對(duì)功能分析表明，在羅氏鼢鼠腸道細(xì)菌基因功能涉及糖類、脂類、蛋白質(zhì)代謝(圖7)。

在門分類水平上顯示，羅氏鼢鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌群主要幫助宿主分解利用植物源食物。羅氏鼢鼠腸道細(xì)菌多屬于厚壁菌門和調(diào)節(jié)腸道糖代謝的擬桿菌門。

3 討論

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在門的水平，羅氏鼢鼠腸道細(xì)菌能夠分解利用植物類資源。主要有放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等，顯示羅氏鼢鼠具有很強(qiáng)的植物源食物適應(yīng)性。奇蹄目(Perissodactyla)的馬(Equus)和驢(Equus)腸道菌群與羅氏鼢鼠的相似[22]。厚壁菌門細(xì)菌有助于代謝腸道中的多糖，而擬桿菌門細(xì)菌能夠幫助宿主從難以消化的食物中獲得能量，并保持動(dòng)物腸道的健康[23]。高脂肪飲食會(huì)顯著地改變雌性小鼠的腸道微生物多樣性，厚壁菌門及該菌門中Leptum菌種的相對(duì)豐富度均顯著下降，可能雌性激素和腸道微生物相互作用有關(guān)[24]。

有研究顯示，植物性食物中的纖維素以及半纖維素在動(dòng)物胃腸道中依靠Firmicutes和Bacteroidetes幫助消化[25]。長(zhǎng)江中下游的草食性白額雁(Anseralbifrons)腸道多樣性由放線菌構(gòu)成、豆雁(Anserfabalis)腸道微生物主要是變形菌，鴻雁(Ansercygnoides)的腸道微生物種由厚壁菌門占主要組成，這些菌類幫助雁類獲取薹草屬(Carex)、禾本科(Gramineae)等草本植物里的能量[26]。在屬的水平上出現(xiàn)的瘤胃球菌屬(厚壁菌門)能幫助消化纖維素和半纖維素為主的植物食物資源，瘤胃球菌屬還有纖維素酶，具有溶解微晶纖維素的功能[27]。草食性動(dòng)物腸道普遍含有顫螺旋菌屬，可以分解宿主體內(nèi)的葡萄糖產(chǎn)生丁鹽酸參與代謝[28]。而羅氏鼢鼠的腸道內(nèi)的Escherichia可能是參與宿主碳水化合物代謝[29]，這可能與在春節(jié)捕獲樣品有關(guān)，食物來源比冬季更多，造成羅氏鼢鼠腸道內(nèi)埃希氏桿菌屬豐度增加[30]。宿主本身的年齡變化也會(huì)導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)改變，從而能影響腸道菌群的組成，在幼年期以兼性厭氧菌為主，例如優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌、梭菌等。隨著年齡增加，好氧菌逐步轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬蹙饕菙M桿菌豐度的持續(xù)增加。成年哺乳動(dòng)物腸道微生物主要類群為厚壁菌門和擬桿菌門。老年動(dòng)物腸道中的擬桿菌門和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)無論是數(shù)量還是多樣性都在下降，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)等細(xì)菌數(shù)量上升。宿主基因型會(huì)通過免疫系統(tǒng)影響腸道菌群的組成[31]。豬類的回腸黏膜菌群組成會(huì)受宿主基因型影響而改變[32]。上述結(jié)果展現(xiàn)出環(huán)境因素可能對(duì)羅氏鼢鼠腸道微生物多樣性有明顯的影響，詳細(xì)的機(jī)制仍需更多的研究。

利用PICRUSt可以研究腸道微生物-宿主-環(huán)境之間的關(guān)系[33]。借助與KEGG的比較搜索，該研究發(fā)現(xiàn)羅氏鼢鼠的腸道菌群編碼的大多數(shù)基因與代謝有關(guān)，其次是涉及遺傳和環(huán)境信息處理。通過預(yù)測(cè)找到了和萜類化合物以及聚酮類化合物代謝相關(guān)的通路(圖6)。作者調(diào)查發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)巴縣當(dāng)?shù)囟喾N植黨參和黃芪，此類藥材中普遍含有萜類化合物[34-35]。真菌和植物共同作用可以合成聚酮類物質(zhì)，具有藥用性能[36]。這顯示羅氏鼢鼠的腸道微生物可能參與調(diào)節(jié)宿主對(duì)中藥材類食物以及特殊環(huán)境的適應(yīng)性。

COG功能分類統(tǒng)計(jì)表明，羅氏鼢鼠腸道細(xì)菌中參與糖類、脂類、蛋白質(zhì)代謝的功能基因具有較高豐度，多屬于一些保守功能[37]。厚壁菌門的微生物具有降解纖維素的功能，幫助鼢鼠調(diào)節(jié)糖代謝[27]。擬桿菌門和變形菌門中很多微生物也會(huì)導(dǎo)致宿主患病而死亡，又可能間接影響鼢鼠的種群數(shù)量[38]。有報(bào)道顯示，鼢鼠的腸道微生物種類更接近哺乳動(dòng)物[5]，因此有必要在搜集更多哺乳動(dòng)物全基因組編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究通過高通量分析腸道菌群的多樣性和菌株在宿主上的功能，對(duì)于探索羅氏鼢鼠對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性具有重要參考價(jià)值[39]，其他環(huán)境以及雄性遺傳因素對(duì)腸道菌群與羅氏鼢鼠的相互作用的影響有待進(jìn)一步研究。

致謝：感謝鎮(zhèn)巴縣泰昌農(nóng)牧有限公司朱艷琴、張生協(xié)助捕獲實(shí)驗(yàn)鼠。