鄒潔建 古河祥 翟俊瓊 薩家祺 陳 武* 杜雪晴*

(1.廣東省野生動物救護中心，廣州，510520；2.廣州動物園，廣州市野生動物研究中心，廣州，510070)

小熊貓(Ailurusfulgens)為我國二級重點保護野生動物，具有獨特的生態(tài)學(xué)價值和觀賞價值，許多動物園都有保育和展示，因人工保育條件下，小熊貓圈養(yǎng)的場地環(huán)境、食物種類、種群密度等因子的影響，小熊貓疾病防控壓力也隨之增大，特別是小熊貓疫病的防控已成為圈養(yǎng)小熊貓保育的重點[1]。小熊貓的主要疫病包括犬瘟熱、細小病毒病、大腸桿菌病、綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)病、克雷伯氏菌病、巴氏桿菌病、嗜水氣單胞菌病等[1-3]。2019年6月，廣東某公司飼養(yǎng)的3只1歲齡雄性小熊貓突然出現(xiàn)臥地不起、呼吸加快、抽搐、口流水樣液體、眼神無光、體溫下降等癥狀，使用慶大霉素等藥物治療無效死亡。解剖發(fā)現(xiàn)心臟塌陷，心包積液；肺嚴(yán)重淤血，水腫，切面浸潤；肝淤血腫脹，局灶性出血，壞死。無菌條件下分別取3只小熊貓的肝臟和肺臟組織樣本進行病原的分離培養(yǎng)與鑒定，結(jié)果從肺臟和肝臟組織樣品中分離培養(yǎng)出1株具有較強致病性的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)。

PA又稱綠膿桿菌，是一種專性需氧革蘭氏陰性菌，為常見的條件致病菌，在自然界中廣泛存在，不同的株型帶有不同的耐藥基因并具有不同的致病性[4]。PA易感染人和動物的肺部、眼角膜、外傷部位等組織，已報道的感染動物種類包括牛(Bostaurus)、林麝(Moschusberezovskii)、斑馬(Equusburchellii)、北美水貂(Mustelavison)等[5-8]，分離獲得的PA菌株攜帶多種耐藥基因，對多種抗生素具有耐藥性[5-10]。研究PA的耐藥性、耐藥機制及耐藥基因轉(zhuǎn)移傳播的途徑對臨床用藥具有指導(dǎo)意義。Bauer和Kirby所建立的紙片瓊脂擴散法(即K-B法)是檢驗細菌對抗菌藥物敏感性而廣泛使用的一種方法，這種方法能鑒定細菌的表型特征，可與耐藥基因的克隆鑒定相互驗證。因此，本研究進行PA藥敏試驗和小鼠致病性試驗，PCR檢測PA的28種β-內(nèi)酰胺酶基因、6種氨基糖苷類修飾酶基因(AMEs)、外膜蛋白D2基因(oprD2)、磺胺耐藥基因(qacE△1-sul1)、3種整合子基因(intⅠ1、2、3)和主動外排泵調(diào)節(jié)基因(mexR)共40種耐藥相關(guān)基因，研究其致病性、耐藥譜和耐藥機制，為小熊貓銅綠假單胞菌病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

普通瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、藥敏紙片、SPF小鼠、革蘭氏染色試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR MasterMix均采購自廣州維寧生物科技有限公司。細菌16S rDNA、耐藥基因的引物合成和測序，均委托廣州睿博興科生物技術(shù)公司完成。

1.2 細菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

無菌采集死亡小熊貓肺臟和肝臟組織，接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)特征，純化至單個菌落。用接種環(huán)挑取平板上單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基。將純化的菌液接種在血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色。

1.3 細菌分離株的藥物敏感性試驗

采用K-B法，按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI)制定的《抗微生物藥物敏感性執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)第22版信息增刊》的操作要求[11]，無菌條件下，將擴增的細菌培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?該管為0.048 mol/L的BaCl2，此時菌液濃度為1.5×108個/mL)均勻涂布于MH培養(yǎng)基，貼上藥敏紙片，于37℃培養(yǎng)24 h后，測量各抑菌環(huán)直徑。依據(jù)說明書上的判斷標(biāo)準(zhǔn)判別分離菌株對所用藥物的敏感程度。藥敏紙片包括：青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢吡肟、頭孢哌酮舒巴坦、丁胺卡那、鏈霉素、慶大霉素、阿奇霉素、氯霉素、利福平、甲硝唑、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星及左氧氟沙星等。

1.4 分離株的PCR檢測及序列分析

取過夜培養(yǎng)的菌液1—2 mL，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌DNA，作為PCR反應(yīng)模板。選用16S rRNA基因通用引物F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[5]進行PCR擴增，目標(biāo)片段約1 600 bp，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，引物F和R各1 μL，DNA模板1 μL，nuclease-free water 9.5 μL，合計總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃，4 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，45 s，35個循環(huán)；72℃，10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳20 min。紫外線下凝膠上出現(xiàn)與目的條帶分子量相同的條帶即判別為陽性。擴增陽性產(chǎn)物送測序公司測序，測序結(jié)果經(jīng)GenBank中BLAST比對，確定其種屬地位。

1.5 耐藥基因的檢測

銅綠假單胞菌的40種耐藥基因的檢測采用PCR法[12-14]，引物序列見表1。以分離菌株的DNA作為模板，進行PCR擴增，檢測相關(guān)耐藥基因。每種耐藥基因的PCR擴增體系均為：每反應(yīng)體系F、R引物各為1 μL(1.0 μmol/L)，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL；nuclease-free water 8.5 μL，DNA模板2 μL，合計總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃ 4 min；95℃ 30 s →Tm℃ 30 s →72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃，7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，紫外線下凝膠上出現(xiàn)與目的條帶分子量相同的條帶即判別為陽性。

表1 40種耐藥基因檢測項目、PCR引物序列及產(chǎn)物長度

續(xù)表1

1.6 PCR擴增產(chǎn)物序列測定與分析

本研究PCR擴增陽性產(chǎn)物外送至公司進行DNA序列測定，所測序列采用GenBank中的BLAST程序進行同源性分析。

1.7 分離菌的毒力試驗

將PA菌24 h肉湯培養(yǎng)液以0.1 mL的量分別腹腔接種SPF小鼠5只，另設(shè)陰性對照組小鼠5只，分別腹腔接種生理鹽水0.1 mL。分別觀察2組小鼠的死亡情況，死亡的小鼠解剖觀察癥狀，切片觀察病理組織變化，與發(fā)病小熊貓的相關(guān)資料進行比較，并做細菌培養(yǎng)與鑒定，72 h后未死亡的小鼠撲殺，取肝肺組織做細菌的培養(yǎng)與鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

從發(fā)病死亡的小熊貓肝臟和肺臟組織分離獲得1株細菌，該菌在血瓊脂平板上形成1—2 mm、半透明/有光澤、表面濕潤、邊緣整齊、圓形凸起的菌落(圖1)。挑取單個純培養(yǎng)的菌落進行涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢。革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓，散在或成對排列(圖2)。

2.2 細菌分離株的藥物敏感性試驗結(jié)果

分離菌對抗生素敏感性試驗結(jié)果見表2。該菌株對青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢吡肟、丁胺卡那、鏈霉素、慶大霉素、阿奇霉素、利福平、甲硝唑、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等耐藥；對頭孢哌酮舒巴坦中度敏感；對氯霉素敏感。

表2 分離菌對抗生素敏感性試驗結(jié)果

2.3 分離株的PCR檢測及序列分析結(jié)果

將細菌PCR陽性產(chǎn)物送至測序公司進行測序，得到序列，將序列上傳至NCBI中進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)所擴增的細菌片段與NCBI上上傳的銅綠假單胞菌序列MH378333.1、MH378332.1、KY962356.1等序列相似性達到100%。

2.4 耐藥相關(guān)基因種類的分布

5種耐藥基因TEM、aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、qacE△1-sul1、intⅠ1為陽性，其他35種為陰性。5種耐藥基因PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖4。

2.5 序列測定及分析

對PCR擴增為陽性產(chǎn)物的DNA測序分析，得到序列，發(fā)現(xiàn) 5種耐藥基因TEM、aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、qacE△1-sul1、intⅠ1引物所擴增的DNA片段均與NCBI上上傳的基因序列相似性達98.48%—99.88%(表3)，確定此菌株含5種耐藥基因TEM、aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、qacE△1-sul1、intⅠ1。

表3 DNA序列比對結(jié)果

2.6 小鼠的致病性實驗

PA組的小鼠在48 h死亡5只，從死亡小鼠肝臟和肺臟分離到接種菌；對照組小鼠未見死亡，撲殺后從肝臟和肺臟分離不到致病菌。死亡小鼠主要表現(xiàn)為急性出血性敗血癥，與發(fā)病小熊貓的癥狀與病理變化一致。

3 討論

PA是常見病原菌，近年來報道PA引起的人和動物的感染不斷增加，常見于免疫力低下，接受抗菌藥物治療的病例，且耐藥問題嚴(yán)重。本次研究的PA菌是從表現(xiàn)急性出血性敗血癥的小熊貓肺臟和肝臟分離培養(yǎng)所得，癥狀與余星明等[15]的研究報道基本一致，該小熊貓使用慶大霉素、頭孢曲松鈉、甲硝唑等藥物治療無效，最終死亡。以分離菌對小鼠進行致病性試驗，小鼠表現(xiàn)與小熊貓相似的癥狀而死亡，說明分離菌具有較強的致病性，是小熊貓發(fā)病死亡的病原體。

表4 分離菌對小鼠致病性的試驗結(jié)果

本研究藥敏試驗結(jié)果表明此株P(guān)A對β-內(nèi)酰胺類的青霉素和阿莫西林，頭孢類的頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢克肟和頭孢吡肟，氨基糖苷類的丁胺卡那、鏈霉素和慶大霉素，大環(huán)內(nèi)酯類的阿奇霉素，硝基咪唑類的甲硝唑，喹諾酮類的諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星以及利福霉素等均耐藥，對頭孢哌酮舒巴坦中度敏感，對氯霉素敏感。據(jù)周麗萍等[16]采集的不同來源的PA耐藥性的分析表明，綜合醫(yī)院分離的PA的耐藥率明顯高于眼專科醫(yī)院的病菌。可能原因是眼科細菌感染的治療較少使用氨基糖苷類及碳青霉烯類藥物，而綜合性醫(yī)院由于病程長，病情復(fù)雜嚴(yán)重而應(yīng)用抗菌藥物時間長，用藥多的緣故。飼養(yǎng)小熊貓的機構(gòu)，使用未經(jīng)熟化處理的牛肉末、牛奶及竹葉飼喂小熊貓，之前2只小熊貓也發(fā)生因采食上述食物而發(fā)生大腸桿菌(Escherichiacoli)感染，而該機構(gòu)長期使用慶大霉素等抗菌藥物治療小熊貓。可能是牛肉等飼料在加工過程中污染了銅綠假單胞菌，小熊貓采食而發(fā)病，而長期使用慶大霉素等抗菌藥物，使PA菌的耐藥性增加，導(dǎo)致治療的失敗。

PA包含細菌所有的6種類型的耐藥機制，即產(chǎn)生抗菌藥滅活酶、藥物作用靶點結(jié)構(gòu)變異、細胞壁外膜通透性降低、細胞膜表面形成主動外排泵系統(tǒng)、形成生物膜屏障、不良環(huán)境導(dǎo)致的適應(yīng)性耐藥等耐藥機制[4]。PA對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制為產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶、頭孢菌素酶等)、外膜蛋白缺失和外排泵[17]。本株P(guān)A菌對青霉素、阿莫西林和頭孢類抗生素具有耐藥性，檢出1種β-內(nèi)酰胺酶基因TEM，表明本株菌對β-內(nèi)酰胺類和頭孢類抗生素耐藥的主要機制是產(chǎn)生大量TEM型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶與抗生素迅速、牢固結(jié)合，使其停留于胞膜外間隙中，因而不能進入靶位發(fā)生抗菌作用。

PA對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機制為產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶(AMEs)或16S rRNA甲基化酶或細胞膜表面形成主動外排泵系統(tǒng)等[17]。編碼AMEs的基因包括乙酰轉(zhuǎn)移酶(aac)、核苷化酶(ant)、腺苷化酶(aad)和磷酸化酶(aph)，修飾氨基糖苷類抗生素的特定基團，降低或喪失對靶位核糖體的親和力[4]。本研究在PA中檢出2種AMEs基因，aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ，說明本株P(guān)A菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥機制與這2種AMEs基因有關(guān)。明德松等[12]也在1株全耐PA菌中檢出aac(3)-Ⅱ基因，張凡[18]在豬、雞體內(nèi)分離的多株P(guān)A菌中檢出aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ等編碼AMES基因。

整合子(int)是一段具有獨特結(jié)構(gòu)和獨立功能的基因組序列，由5′保守端、3′保守端和二者之間的可變區(qū)組成，許多革蘭氏陰性菌的耐藥基因以基因盒的形式存在于整合子的可變區(qū)，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子[19]。PA基因組的Ⅰ類整合子可攜帶多種耐藥基因盒，包括β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、甲氧芐啶類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類和四環(huán)素類等抗菌藥物的耐藥基因盒，從而產(chǎn)生多藥耐藥性[4]。Ⅰ類整合子5′保守端有編碼整合酶的intⅠ1基因及啟動子，3′端為耐消毒劑和磺胺基因(qacE△1-sul1)。intⅠ1與qacE△1-sul1同為Ⅰ類整合子的遺傳標(biāo)記，qacE△1-sul1也是耐季銨鹽化合物和磺胺的基因遺傳標(biāo)記[19]。整合酶2基因(intⅠ2)為Ⅱ類整合子的遺傳標(biāo)記，整合酶3基因(intⅠ3)為Ⅲ類整合子遺傳標(biāo)記。本株P(guān)A菌檢出Ⅰ類整合子，未檢出Ⅱ、Ⅲ類整合子，說明本株P(guān)A的耐藥機制與Ⅰ類整合子有關(guān)，與Ⅱ、Ⅲ類整合子無關(guān)；同時本株P(guān)A的qacE△1-sul1基因為陽性，說明其耐藥機制也與qacE△1-sul1基因有關(guān)。孫光明[19]對多株P(guān)A菌的檢測也發(fā)現(xiàn)Ⅰ類整合子較普遍，Ⅱ類整合子比較少見，未發(fā)現(xiàn)Ⅲ類整合子。此外銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子可攜帶aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb等耐藥基因[20-21]，本株菌攜帶的aac(3)-Ⅱ基因與intⅠ1和qacE△1-sul1基因同時陽性，表明本菌株攜帶的aac(3)-Ⅱ基因也很可能位于Ⅰ類整合子中。

PA作為人畜共患病原菌，對其防控具有非常重要的意義。新的耐藥基因會在基因的變異過程中不斷產(chǎn)生，且細菌的許多耐藥基因可通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、噬菌體等可移動遺傳元件轉(zhuǎn)移和傳播，耐藥菌株層出不窮，對感染性疾病的防治帶來了極大的挑戰(zhàn)。因此應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果合理使用抗菌藥物，此外還需開發(fā)疫苗、抗菌肽等新的生物治療方法進行耐藥菌的防治。