王琰 易翅翔 邱勛永 陳鵬 明光福

(海南省人民醫(yī)院·海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院顯微手外科，海南 海口 570100)

骨愈合延遲或失敗是困擾骨科醫(yī)生的一個嚴重問題，70%以上的高能骨折患者至少需要進行一次骨外科手術。約5%～10%的高能骨折患者在接受常規(guī)治療后會出現(xiàn)愈合延遲或骨不連現(xiàn)象[1]。骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)為促進骨折愈合提供了一種新的治療策略，可以促進骨折愈合[2]。BMSCs遷移到骨折部位、提供抗氧化保護和分化為成骨細胞，在骨折愈合中具有重要作用[3]。骨折后，內源性BMSCs向骨折部位遷移是成骨細胞成熟和礦化組織形成的關鍵步驟。BMSCs向骨折部位遷移并分化為成骨細胞和軟骨母細胞，通過膜內骨化或軟骨內骨化促進骨折愈合[4]。異槲皮苷(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)是天然黃酮醇槲皮素的主要糖苷形式之一，廣泛存在于水果、蔬菜、藥材和植物源性食品中[5]。有研究表明，異槲皮苷可通過多種途徑發(fā)揮增殖、凋亡、抗氧化和抗炎作用[6]。此外，有證據顯示，異槲皮苷可通過促進BMSCs增殖、ALP活性和鈣沉積，上調runt相關轉錄因子2(Runt-Related Transcription Factor 2，Runx2)表達促進上頜快速擴弓中腭中縫骨形成[7]。因此，本研究旨在探討異槲皮苷通過促進大鼠骨髓間充質干細胞遷移和成骨分化對大鼠骨折愈合的影響，以期為進一步了解異槲皮苷在骨折中的作用機制及開發(fā)更有效的骨折治療策略提供新的科學資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級，雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠45只，6～8周齡，體質量200～250 g，購自海南省醫(yī)學實驗動物中心[生產許可證號SCXK(瓊)2018-0007]。大鼠飼養(yǎng)于我院標準動物房，使用許可證號：SYXK(瓊)2018-0006，環(huán)境溫度19～24 ℃，相對濕度45%～55%。大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水。本實驗獲得我院實驗動物福利倫理委員會批準，編號HNZC. No20180930c0501210。

1.2 主要試劑 異槲皮苷粉劑，產品純度：HPLC≥98%，產品批號：JOT-10129(成都普菲德生物技術有限公司)；FITC-CD29抗體(英國Abcam公司)；PE-CD90抗體(英國Abcam公司)；FITC-CD45抗體(英國Abcam公司)；PE-CD31抗體(英國Abcam公司)；CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Transwell小室(美國康寧公司)；茜素紅S染液(北京索萊寶科技有限公司)；Runx2抗體(英國Abcam公司)；OCN抗體(英國Abcam公司)；Ⅰ型膠原抗體(英國Abcam公司)；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；HRP標記二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；胎牛血清(美國賽默飛世爾科技公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；Percoll細胞分離液(北京華越洋生物科技有限公司)；間充質干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基(深圳市百恩維生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs分離與培養(yǎng)[8]取5只6周齡SD大鼠，處死大鼠。大鼠經75%酒精消毒后，剖取大鼠股骨，用DMEM培養(yǎng)基沖洗股骨髓腔，收集沖洗液，過尼龍網。隨后加入等體積Percoll細胞分離液，2400 r/min離心20 min。收集離心管中間的白色層，PBS清洗2次后，用含10%FBS的DMEM重懸細胞，然后以2×105/cm2的細胞密度接種于培養(yǎng)皿，72 h后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細胞，以后每3 d換液一次。細胞傳3代后進行實驗。

1.3.2 流式細胞術 對數(shù)期生長的BMSCs經0.25%胰酶消化后，取1×106個/孔BMSCs，PBS重懸細胞，加入FITC-CD29(1∶200)、PE-CD90(1∶300)、FITC-CD45(1∶300)和PE-CD31(1∶200)抗體，避光孵育30 min。PBS洗滌細胞并重懸。上流式細胞儀檢測CD29、CD90、CD45和CD31陽性細胞比例。

1.3.3 油紅O染色 當BMSCs長至約80%～90%密度時，將培養(yǎng)基替換為成脂細胞特異性誘導培養(yǎng)基(含10%FBS，10 mMβ-甘油磷酸鈉，1 μM地塞米松，0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤， 10 μM胰島素和200 μM吲哚美辛的低糖DMEM)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)14 d。BMSCs棄去成脂誘導培養(yǎng)基，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定。PBS清洗細胞后，0.3%紅油O室溫染色20 min。棄去染液，蒸餾水洗滌后，顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 骨髓間充質干細胞成骨誘導分化 對數(shù)期生長的BMSCs經0.25%胰酶消化后，將BMSCs移入離心管內，1000 rpm離心5 min，去除上清，間充質干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基重懸細胞，以5×103cells/cm2細胞密度接種于培養(yǎng)皿，細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4 d換一次培養(yǎng)基。

1.3.5 茜素紅S染色 BMSCs經過21 d成骨分化培養(yǎng)后，移除培養(yǎng)基，PBS清洗細胞，4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min。PBS清洗后，加入茜素紅S染色3 min。PBS清洗后，光學顯微鏡下進行顯色觀察分析。

1.3.6 ALP活性檢測 BMSCs經過21 d成骨分化培養(yǎng)后，收集BMSCs，按照ALP檢測試劑盒說明書進行BMSCs的ALP活性檢測。

1.3.7 CCK-8檢測 BMSCs接種于96孔板中，5×103個/孔，96孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。異槲皮苷用PBS溶解，分別以5、10、20、40、80 μmol/L終濃度處理BMSCs，對照組細胞添加PBS，細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。向每孔內加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃條件下孵育3 h。酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值。

1.3.8 Transwell實驗 對數(shù)期生長的BMSCs經0.25%胰酶消化后，無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調整濃度為3×105個/mL。下室加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，上室加入150 μL細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，0.1%結晶紫染色，顯微鏡拍照和觀察。

1.3.9 Western blot檢測 BMSCs經過21 d成骨分化培養(yǎng)后，收集BMSCs，RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離，隨后轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入Runx2抗體(1∶1000)、OCN抗體(1∶1000)和GAPDH(1∶10000)，4 ℃條件下過夜孵育。加入HRP標記二抗(1: 5000稀釋)室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化學發(fā)光成像儀檢測。

1.3.10 大鼠模型制備[9]與處理 40只SD大鼠適應環(huán)境1周后，隨機分為對照組、BMSC組、異槲皮苷組和BMSC+異槲皮苷組，每組10只。所有大鼠使用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)。右膝行髕骨內側切口，暴露股骨髁間凹，在髁內鉆一個孔后，將克氏針沿脛骨平臺插入脛骨髓腔。使用鋼鋸橫行截斷股骨，形成橫行骨折。傷口青霉素消毒，隨后縫合傷口。術后給予注射青霉素預防感染。術后第1 d開始藥物干預：BMSC+異槲皮苷組尾靜脈注射2×106個BMSC，腹腔注射40mg/kg異槲皮苷[10]；對照組尾靜脈和腹腔注射等量PBS; BMSC組大鼠經尾靜脈注射2×106個BMSC，腹腔注射等量PBS; 異槲皮苷組腹腔注射40 mg/kg異槲皮苷，尾靜脈注射等量PBS。每天給藥1次，最后一次給藥為處死大鼠前1 d。

1.3.11 X線檢測 骨折后2周或3周，使用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，使用數(shù)字X射線機，電壓45 kV，曝光時間0.06 ms，獲得前后位的放射照片，并采集股骨。對骨折愈合進行評分[11]：1分，無鈣化；2分，斑片狀鈣化；3分，鈣化有骨痂出現(xiàn)；4分，骨痂跨越骨折間隙；5分，骨小梁連續(xù)；6分，正常骨重建。

1.3.12 免疫組化 取骨痂組織，常規(guī)石蠟包埋切片、脫蠟水化，H2O2封閉內源性過氧化物酶，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，加入OCN(1∶200)和I型膠原(Collagen type I，Col I)(1∶200)抗體4 ℃過夜孵育。二抗(1∶500)室溫孵育1 h。DAB顯色10 min，PBS沖洗后，蘇木精復染3 min，自來水沖洗1 min脫水、透明、封片、鏡檢。

免疫組化評分[12]是通過將免疫反應細胞百分比(A，數(shù)量分數(shù))與染色強度(B，染色強度分數(shù))的估算值結合起來計算的：A，無陽性細胞=0，1%～10%陽性細胞=1，11%～50%陽性細胞=2，51%～80%陽性細胞=3，81%～100%陽性細胞=4；B： 陰性=0，弱陽性=1，中等陽性=2，強陽性=3。

2 結果

2.1 BMSCs分化潛能的鑒定 原代BMSCs細胞大小不一，形狀不規(guī)則；BMSCs傳代至第三代時，細胞形態(tài)呈紡錘形，大小均一，見圖1。流式細胞術實驗結果顯示，CD29和CD90陽性率分別為99.0%和96.9%，CD45和CD31陽性率均為1.74%，見圖2。油紅O染色、ALP活性檢測和茜素紅S染色結果顯示，BMSCs具有誘導脂質形成、ALP活性升高和鈣沉積的能力，即BMSCs具有成脂和成骨分化潛能，見圖3。因此，BMSCs可用于后續(xù)實驗。

圖1 顯微鏡觀察BMSCs細胞形態(tài)(200×)

圖2 流式細胞術檢測BMSCs表面分子標志物CD29、CD90、CD45和CD31的表達

圖3 BMSCs成脂和成骨分化潛能的鑒定(200×)

2.2 異槲皮苷對BMSCs增殖的影響 與對照組相比，異槲皮苷在5、10、20 μmol/L濃度下促進BMSCs增殖，其中10 μmol/L效果最為明顯，異槲皮苷在80 μmol/L濃度下抑制BMSCs增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而異槲皮苷在40 μmol/L濃度下對BMSC增殖無明顯影響，見表1。

2.3 異槲皮苷促進BMSCs遷移 Transwell實驗結果顯示，與對照組相比，異槲皮苷在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下促進BMSCs遷移，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

表1 異槲皮苷對BMSCs增殖的影響

2.4 異槲皮苷促進BMSC的成骨分化 與對照組相比，異槲皮苷在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下促進BMSC中鈣沉積、ALP活性、Runx2和OCN蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖5。

2.5 異槲皮苷協(xié)同BMSCs促進大鼠股骨骨折模型的骨折愈合 與對照組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而BMSC組和異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨折愈合評分無明顯差異(P>0.05)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，BMSC組、異槲皮苷組和BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖4 異槲皮苷促進BMSCs遷移(100×)

圖5 異槲皮苷促進BMSCs的成骨分化(100×)

圖6 異槲皮苷協(xié)同BMSC促進大鼠股骨骨折模型的骨折愈合

2.6 異槲皮苷促進骨痂中骨鈣素(Osteocalcin, OCN)OCN和ColⅠ的表達 與對照組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而BMSC組和異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達無明顯差異(P>0.05)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比，BMSC組、異槲皮苷組和BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7～8。

圖7 異槲皮苷促進骨痂中OCN的表達

3 討論

骨折是最常見的外科損傷之一，對患者的正常生活產生較大影響。骨折的一般治療方法是將移位的關節(jié)和骨結構對齊，然后進行固定，因為骨折愈合是器官自身的修復過程，該過程包括炎癥反應、成骨、骨痂形成和重塑[13]。高能骨折是一種嚴重的創(chuàng)傷，愈合時間長[14]，5%～10%的高能骨折患者在接受常規(guī)治療后會導致愈合延遲或骨不連[1]。臨床醫(yī)生可以通過一些輔助治療促進骨折愈合，以防止延遲愈合或骨不連。有研究表明，骨愈注射液，對骨痂的形成和重塑有很好的作用，但在骨折愈合早期愈合效果較差。骨瓜提取物注射液可促進骨折愈合，但可能引起過敏性休克[15]。因此，開發(fā)安全有效的新藥物，對促進骨折愈合具有重要意義。異槲皮苷在疾病中發(fā)揮抗氧化、抗凋亡和抗炎作用[16]。此外，有證據顯示，異槲皮苷可促進上頜快速擴弓中腭中縫骨形成[7]，但其對骨折的影響及可能的作用機制尚不明確。

圖8 異槲皮苷促進骨痂中ColⅠ的表達

BMSCs具有高度的分化能力，是有效治療骨折的理想來源。據報道，干細胞療法對骨組織修復具有有益的作用，BMSCs移植可以刺激動物骨缺損模型中的骨痂形成[17]。間充質干細胞分泌的生長因子和細胞因子通過多種信號途徑調節(jié)組織修復[18]。證據顯示，Runx2是成骨分化過程中的一個重要轉錄因子，ALP和OCN是成骨分化的標志物，低濃度異槲皮苷能促進成骨細胞和BMSCs增殖，高濃度的異槲皮苷可上調MC3T3-E1成骨細胞系ALP活性、Runx2和OCN表達，促進成骨分化[19]。本研究結果顯示，異槲皮苷可促進BMSCs增殖和遷移，促進BMSCs中鈣沉積、ALP活性、Runx2和OCN蛋白表達。這表明，在體外實驗中，異槲皮苷可促進BMSCs遷移和成骨分化。褪黑素通過誘導間質干細胞成骨細胞分化促進股骨骨折大鼠模型的骨折愈合[20]。辛伐他汀通過Wnt/β-catenin途徑誘導MSCs成骨分化促進骨折愈合[21]。在骨折愈合過程中，Col I主要在軟骨向編織骨過渡形成時，刺激成骨細胞合成[22]。本研究結果顯示，異槲皮苷和BMSCs均可促進骨痂中OCN和Col I產生，從而促進骨折愈合，其中異槲皮苷和BMSCs的聯(lián)合使用比BMSCs的單一使用效果更佳。該結果表明，異槲皮苷聯(lián)合BMSCs在骨折治療方面具有巨大潛力。

4 結論

異槲皮苷可能通過促進BMSCs遷移和成骨分化加速大鼠骨折愈合。該研究結果為進一步明確異槲皮苷在骨折中的作用及開發(fā)新的骨折相關的治療藥物提供了新的科學資料。但本研究沒有對異槲皮苷促進BMSCs遷移和成骨分化的具體機制作進一步探討，后續(xù)實驗將以此為研究方向，進一步探明異槲皮苷對BMSCs調控的具體機制。