李鑫靚，張樹明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

黃芪具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒功效，是治療慢性腎衰的臨床常用藥之一。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪最具活性的主要成分之一，具有明顯的抗氧化、抗病毒、免疫抑制等多種藥理作用[1]，同時(shí)也是中國藥典對(duì)黃芪進(jìn)行質(zhì)量控制的主要成分之一。目前研究慢性腎衰患者腸道菌群體外對(duì)其代謝影響的較少，因此本實(shí)驗(yàn)以黃芪水提物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷為檢測(cè)對(duì)象，采用腸道菌液體外培養(yǎng)代謝的方法，來探究脾腎兩虛證及濕濁內(nèi)蘊(yùn)證慢性腎衰患者腸道菌液體外對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷的代謝變化差異,為臨床不同證型患者用藥提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣本來源 采集黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院腎病科濕濁內(nèi)蘊(yùn)型、脾腎兩虛型住院患者及該院體檢中心健康人的糞便樣本各10例作為實(shí)驗(yàn)樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 黃芪購于北京同仁堂哈爾濱中山路店，經(jīng)檢測(cè)符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。GAM培養(yǎng)基：海博生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：HB8518-1；EE肉湯：海博生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：HB0126；氯化鈉注射液：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司；甲醇(色譜純)：美國Tedia公司；乙腈(色譜純)：美國Tedia公司；其余溶劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)：美國Waters公司；Waters2489熒光檢測(cè)器：美國Waters公司；BSA-224S-CW電子天平：德國賽多利斯公司；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒有限公司)；冷凍離心機(jī)：德國賽默飛世爾公司；DL-CJ-1N型超凈臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；WH-Z微型渦旋混懸儀：北京京立離心機(jī)有限公司；-80 ℃冰柜：SANYO Electric Co.，Ltd。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液制備 稱取黃芪60 g，分別加入10倍量、8倍量、8倍量水煎煮3次，均為武火水沸騰后，文火煎煮30 min，紗布過濾。合并濾液水浴濃縮后105 ℃烘干，研成粉末備用。實(shí)驗(yàn)前取該粉末5 g加入10 mL水制成0.5 g/mL黃芪水提取物藥液。

2.2 菌液制備 取每份樣本0.6 g，加入2.4 mL生理鹽水，渦旋3 min，5 000 r/min離心5 min分離獲得上清液。分別取上清液1 mL，按1∶9分別厭氧培養(yǎng)基、好氧培養(yǎng)基后渦旋混勻，在厭氧及好氧條件下37 ℃培養(yǎng)24 h，制成腸道厭氧菌液、腸道好氧菌液。

2.3 樣品處理 分別取各樣本的腸道厭氧、好氧菌液160 μL，各加入40 μL藥液，混勻后37 ℃進(jìn)行厭氧和好氧培養(yǎng)，分別于0、4、12、24 h取出平行樣，加入5倍量的甲醇溶液終止代謝。渦旋3 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇復(fù)溶，過濾膜到進(jìn)樣瓶中作為樣品待測(cè)。

2.4 色譜條件 色譜柱：WatersC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；Waters熒光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。流動(dòng)相參數(shù)設(shè)置條件參考劉玲等[2]條件。測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，同時(shí)計(jì)算0～4 h、4～12 h、12～24 h時(shí)段的代謝速率及0～4 h、0～12 h、0～24 h時(shí)段的累積代謝速率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，選擇重復(fù)測(cè)量方差分析。以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組腸道菌液對(duì)黃芪水提物毛蕊異黃酮葡萄糖苷不同時(shí)間點(diǎn)含量的影響 見表1～表2。

表1 好氧條件下各組腸道菌液對(duì)黃芪水提物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷不同時(shí)間點(diǎn)含量的影響

表2 厭氧條件下各組腸道菌液對(duì)黃芪水提物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷不同時(shí)間點(diǎn)含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在好氧條件下，各組隨時(shí)間的延長(zhǎng)在4、12、24 h時(shí)間點(diǎn)與其前一時(shí)間點(diǎn)比較毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均大幅下降。與健康對(duì)照組比較：毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量濕濁內(nèi)蘊(yùn)組各時(shí)間點(diǎn)均降低，但只有4 h時(shí)具有顯著性差異(P<0.05)，脾腎兩虛組除24 h降低外其余各時(shí)間點(diǎn)均有所增高，但均無顯著性差異(P>0.05)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在厭氧條件下，各組隨時(shí)間的延長(zhǎng)在4、12、24 h時(shí)間點(diǎn)與其前一時(shí)間點(diǎn)比較毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量大幅下降。與健康對(duì)照組比較：毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量濕濁內(nèi)蘊(yùn)組各時(shí)間點(diǎn)均降低但只有4、24 h時(shí)具有顯著性差異(P<0.05)；脾腎兩虛組除各時(shí)間點(diǎn)均有所增高，但均無顯著性差異(P>0.05)。

3.2 各組腸道菌液對(duì)黃芪水提物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷不同時(shí)段代謝速率的影響 結(jié)果見表3～表4。

表3 好氧條件下各組腸道菌液對(duì)黃芪水提物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷不同時(shí)段代謝速率的影響

表4 厭氧條件下各組腸道菌液對(duì)黃芪水提物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷不同時(shí)段代謝速率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在好氧條件下，各組第二、三時(shí)段與第一時(shí)段相比毛蕊異黃酮葡萄糖苷代謝平均速率均下降，健康對(duì)照組第三時(shí)段、濕濁內(nèi)蘊(yùn)組第二、三時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)，各組第三時(shí)段與第二時(shí)段相比除健康對(duì)照組下降外其余兩組均升高，脾腎兩虛組具有顯著性差異(P<0.05)。與健康比較,脾腎兩虛組第一、二時(shí)段下降但無顯著性差異(P>0.05)，第三時(shí)段升高具有顯著性差異(P<0.05)；濕濁內(nèi)蘊(yùn)組第二時(shí)段下降但無顯著性差異(P>0.05)，第一、三時(shí)段升高具有顯著性差異(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在厭氧條件下，各組第二、三時(shí)段與第一時(shí)段相比毛蕊異黃酮葡萄糖苷代謝速率均下降，健康對(duì)照組第三時(shí)段、濕濁內(nèi)蘊(yùn)組第二、三時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)，各組第三時(shí)段與第二時(shí)段相比除健康對(duì)照組下降外其余兩組均升高，均無顯著性差異(P>0.05)。與健康比較脾腎兩虛組第一時(shí)段下降、第三時(shí)段升高但無顯著性差異(P>0.05)，第二時(shí)段下降具有顯著性差異(P<0.05)，濕濁內(nèi)蘊(yùn)組各時(shí)段均升高，第一時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)其余無顯著性差異(P>0.05)。

3.3 各組腸道菌液對(duì)黃芪水提物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積代謝速率的影響 見表5～表6。

表5 好氧條件下不同時(shí)間點(diǎn)各組患者腸道菌群對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積代謝速率的影響

表6 厭氧條件下不同時(shí)間點(diǎn)各組患者腸道菌群對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積代謝速率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在好氧條件下，各組第二、三時(shí)段與第一時(shí)段相比毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積代謝速率均下降，健康對(duì)照組第二、第三時(shí)段、濕濁內(nèi)蘊(yùn)組第二、三時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)，各組第三時(shí)段與第二時(shí)段相比各組均下降，健康對(duì)照組、濕濁內(nèi)蘊(yùn)組第三時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)。與健康組比較毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積代謝速率，脾腎兩虛組第一、二時(shí)段下降、第三時(shí)段升高但無顯著性差異(P>0.05)，濕濁內(nèi)蘊(yùn)組各時(shí)段均升高、第一時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在厭氧條件下，各組第二、三時(shí)段與第一時(shí)段相比毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積代謝速率均下降，濕濁內(nèi)蘊(yùn)組第二、三時(shí)段具有極顯著性差異(P<0.01)，各組第三時(shí)段與第二時(shí)段相比各組均下降，健康對(duì)照組、濕濁內(nèi)蘊(yùn)組第三時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)。與健康比較脾腎兩虛組第一時(shí)段升高，第二、三時(shí)段下降但均無顯著性差異(P>0.05)，濕濁內(nèi)蘊(yùn)組各時(shí)段均升高，只有第一時(shí)段、第三時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)。變化趨勢(shì)濕濁內(nèi)蘊(yùn)組具有顯著性差異(P<0.05)；與濕濁內(nèi)蘊(yùn)組比較脾腎兩虛組各時(shí)段下降，但第二時(shí)段有極顯著性差異(P<0.01)、第三時(shí)段具有顯著性差異(P<0.05)。

4 討論

黃芪作為補(bǔ)氣藥在治療慢性腎衰臨床處方中起到重要作用[3-6]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是中國藥典規(guī)定黃芪成分含量測(cè)定的主要成分之一。藥物口服進(jìn)入腸道后必然與腸道菌群接觸，腸道菌群對(duì)藥物成分如何影響目前是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究參照臨床湯劑的制備方法制成了黃芪水提物溶液，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了腸道菌液在厭氧及好氧條件下對(duì)黃芪水提物溶液影響的研究。本研究表明：脾腎兩虛組與濕濁內(nèi)蘊(yùn)組患者腸道菌群對(duì)黃芪水提物溶液毛蕊異黃酮葡萄糖苷代謝均有一定影響，但以濕濁內(nèi)蘊(yùn)組影響更為顯著，并且兩組間也存在顯著差異。進(jìn)而表明無論脾腎兩虛證還是濕濁內(nèi)蘊(yùn)證慢性腎衰患者腸道菌群結(jié)構(gòu)較健康人群均發(fā)生明顯變化，并且脾腎兩虛證患者、濕濁內(nèi)蘊(yùn)證患者同樣存在差異。腸道菌群對(duì)含糖苷鍵中藥成分水解反應(yīng)是其影響代謝的最主要方式之一[7]，陳爍吉[8]等研究表明腸道是毛蕊異黃酮葡萄糖苷最主要的代謝場(chǎng)所，Ruan等人[9]還認(rèn)為毛蕊異黃酮葡萄糖苷在腸道內(nèi)經(jīng)腸道菌群代謝水解代謝成其苷元——毛蕊異黃酮，并且毛蕊異黃酮具有促進(jìn)血管內(nèi)皮新生、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞減輕其凋亡的作用[10-12]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可推導(dǎo)黃芪水提物溶液經(jīng)慢性腎衰患者腸道菌群作用毛蕊異黃酮葡萄糖苷代謝為毛蕊異黃酮而發(fā)揮保護(hù)腎臟內(nèi)皮細(xì)胞作用，從而達(dá)到治療慢性腎衰的目的。并且黃芪水提物溶液發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用在濕濁內(nèi)蘊(yùn)證慢性腎衰患者表現(xiàn)更為突出。上述推論本課題將在后續(xù)工作中進(jìn)一步驗(yàn)證。