孫 妍，王 靜，侯 喆，武天元，王偉明

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036;2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·黑龍江 哈爾濱 150040)

1 材料

1.1 實驗動物 100只BALB/c小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(京)2012-0001。

1.2 菌株 肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCCFH15531)：美國菌株保藏中心。

1.3 藥物及試劑 麥冬飲片：河北安國振宇藥業(yè)有限公司，批號：130109，經(jīng)鑒定麥冬為四川麥冬Radix Ophiopogonis(Thunb.)Ker-Gawl.的干燥塊根；阿奇霉素分散片(哈藥集團制藥六廠，批號：30130502)；養(yǎng)陰清肺糖漿：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：3150021。TRIzol試劑：美國Invitrogen；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit：TaKaRa 公司；MUC5ac引物、β-actin引物：哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司；小鼠黏蛋白5ac(MUC5ac)檢測試劑盒：USCN Life Science Inc.；PPLO培養(yǎng)基：Becton，Dickinson and Company，USA。試藥均在給藥前研磨成粉，溶解，渦旋混勻。

1.4 主要儀器 DL-CJ-1W生物凈化工作臺：北京東連哈爾儀器制造有限公司；MDF-382E-80 ℃低溫冰箱：日本三洋公司；Milli-Q Reference system自動雙重純水蒸餾器：MILLI-Q公司；SorvaⅡ ST16低溫離心機：Thermo公司；2、20、200μL微量加樣器：Eppendoff公司；9600熒光定量PCR儀：杭州博日有限公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀：Tecan公司。

2 方法

2.1 肺炎支原體培養(yǎng) 將MP菌株按1∶9加入到PPLO完全培養(yǎng)基中，置37 ℃生化培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每天觀察顏色變化，培養(yǎng)液由紅色變?yōu)辄S色并澄清透明時即為支原體生長。將處于對數(shù)生長期的MP進行CCU定量，常規(guī)凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組 100只BALB/c小鼠，隨機分為10組，每組10只。分別為正常對照組，模型對照組，阿奇霉素組，養(yǎng)陰清肺組，麥冬多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組和麥冬皂苷高劑量組、中劑量組、低劑量組。

2.3 造模、給藥及標(biāo)本采集 除正常對照組外，其余各組用乙醚麻醉，然后用無菌注射器吸取106CCU/mLMP，滴鼻復(fù)制MP感染模型，20μL，連續(xù)感染3 d；之后各組小鼠開始灌胃給藥，正常組和模型組灌胃等容積生理鹽水，阿奇霉素組給藥5 d(第1天給65 mg/kg，第2～5天給32.5 mg/kg)、養(yǎng)陰清肺組(5 mL/kg)、麥冬多糖高劑量組(81.2 mg/kg)、麥冬多糖中劑量組(40.6 mg/kg)、麥冬多糖低劑量組(20.3 mg/kg)、麥冬皂苷高劑量組(66.8 mg/kg)、麥冬皂苷中劑量組(33.4 mg/kg)、麥冬皂苷低劑量組(16.7 mg/kg)，連續(xù)給藥6 d。頸椎脫臼處死小鼠，肺門處結(jié)扎右主支氣管后向左側(cè)肺內(nèi)注入生理鹽水1mL，反復(fù)抽洗2次，合并灌洗液，3 000r/min，4 ℃離心10 min，收取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆?；剪取右肺組織中葉，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察指標(biāo)及測定

2.4.1 Real-time PCR方法檢測MUC5ac mRNA的表達 取100 mg組織置于離心管中，加入適量去離子水，用勻漿機打勻，加入1 mLtrizol(預(yù)冷)提取RNA；以DEPC H2O做空白調(diào)零，混勻樣品在260、280 nm波長下讀數(shù)，OD260/OD280的比值用于估算核酸純度，計算總RNA濃度，調(diào)整樣品體積。以β肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參照，MUC5AC正向引物：5′-ACCACTTTCTCCTTCTCCACAC-3′，反向引物：5′-AACAGGGCTCTTCACAGACAATA-3′；β-actin 正向引物：5′-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3′，反向引物：5′-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3′。PCR擴增儀進行循環(huán)擴增：42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 sec,1 cycle；95 ℃ 5 sec,60 ℃ 20 sec,40 cycle；95 ℃0 sec,65 ℃15 sec,95 ℃ 0 sec。采用比較閾值法分析基因表達的量，直接得到各組小鼠肺組織MUC5ac mRNA對空白組相對表達的量。采用2-ΔΔCt公式，相對定量的方法進行計算，得出的相對表達量。

2.4.2 ELISA檢測BALF中MUC5ac蛋白的含量 按試劑盒說明書操作。

3 結(jié)果

3.1 麥冬有效部位對MP感染小鼠肺組織MUC5ac蛋白表達的影響 見表1。

表1 各組小鼠肺組織MUC5AC mRNA 表的比較

3.2 麥冬有效部位對MP感染小鼠BALF中 MUC5ac蛋白含量的影響 見表2。

表2 各組小鼠 BALF中 MUC5ac蛋白含量比較

4 討論

正常情況下，氣道黏膜腺體和杯狀細胞為保持呼吸道黏膜的濕潤時只分泌少量黏液，當(dāng)某些病因刺激呼吸道時，氣道黏液分泌量明顯增多，并通過咳嗽和纖毛運動將其排出，但持續(xù)的黏液分泌增多可導(dǎo)致氣道阻滯、氣流不暢、肺功能進行性降低。氣道中的黏液是由不同分泌物混合而成，黏蛋白(muc)是氣道黏液中的重要組成部分，其數(shù)量和性質(zhì)決定氣道黏液的黏度。在已有的21 種黏蛋白中，杯狀細胞分泌的MUC5ac為氣道中主要的分泌性黏蛋白，MUC5ac的過度表達是氣道黏液分泌量及黏液黏度增加的主要原因[6]。

肺炎支原體肺炎是由肺炎支原體引起的呼吸道和肺部急性炎癥。2-3d后出現(xiàn)明顯呼吸道癥狀，陣發(fā)性刺激性咳嗽為突出表現(xiàn)，咳少量黏液或黏液膿性痰。由肺炎支原體還可引起支氣管擴張[7]，并與支氣管哮喘[8]有較強的關(guān)聯(lián)性。

本實驗在對肺組織中MUC5ac基因表達情況及BALF中MUC5ac含量進行檢測時，結(jié)果顯示，小鼠在正常情況下MUC5ac表達量極少，MP小鼠模型組與正常組相比MUC5ac表達含量明顯上升，提示MPP可致肺部MUC5ac生成增加，氣道黏液分泌量增多。麥冬多糖組與麥冬皂苷組可明顯降低MP所致小鼠肺組織MUC5ac的表達，提示麥冬有效部位可通過調(diào)節(jié)MUC5ac的表達，減少肺組織黏蛋白的分泌，降低氣道黏液分泌量及黏液的粘度，起到祛痰止咳作用。但麥冬有效部位的劑量與MUC5ac的表達沒有明確的量效關(guān)系，需通過后續(xù)實驗進行闡明。