李 英，杜春梅

（1黑龍江大學農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500 2黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱150080）

0 引言

尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是一種物種復(fù)合體(Species complex)，包括非致病性和致病性的分離菌株。非致病性尖孢鐮刀菌分離株通常作為腐生菌存在于土壤中，也可以在植物組織中分離到，是常見的植物內(nèi)生菌，一些非致病分離株可作為生物防治劑來使用[1]。致病性尖孢鐮刀菌具有廣泛的寄主范圍，能夠造成100多種植物物種枯萎或者腐爛，目前已被列為世界上第五大植物病原真菌（前4種分別為稻瘟病菌Magnaporthe oryzae，灰霉病菌Botrytis cinerea，禾柄銹菌Puccinia spp.，禾谷鐮刀菌F.graminearum）[2]。根據(jù)其宿主特異性尖孢鐮刀菌被劃分為120多種?；?F.spp.)[3]，在不同植物上引起的癥狀最常見的是維管束萎蔫，有時引發(fā)組織腐爛，一些植物可能會同時發(fā)生這兩種癥狀[4-5]。有腐爛癥狀的疾病稱為基腐病、鐮刀菌莖腐病或冠根腐病。目前對尖孢鐮刀菌還沒有理想的防治方法，而充分了解尖孢鐮刀菌的致病機制是對抗這種疾病的先決條件，是研究和實施有效控制策略從而限制宿主植物感染的必要基礎(chǔ)[6]。目前對于尖孢鐮刀菌的致病機理的研究主要為導(dǎo)管阻塞及產(chǎn)生的致病毒素對其宿主植物的侵染，而對于其調(diào)控因子及信號傳遞通路研究甚少。本文對尖孢鐮刀菌侵染的毒力因子、信號途徑等進行了總結(jié)，包括致病性尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶、毒素，以及與侵染過程相關(guān)的調(diào)控基因、轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以期為開發(fā)有效的尖孢鐮刀菌防治技術(shù)提供靶點和思路。

1 毒力因子

尖孢鐮刀菌的致病作用主要由侵染結(jié)構(gòu)的附著和穿透[4,7]、細胞壁降解酶、毒素三部分組成。其中在病害的發(fā)生發(fā)展進程中，細胞壁降解酶和毒素的作用是非常重要的。

1.1 細胞壁降解酶

尖孢鐮刀菌在穿透根細胞壁直到在宿主植物定殖期間會分泌一系列的細胞壁降解酶(Cell wall degrading enzymes，CWDEs)，在降解植物細胞壁以及宿主與病原體相互作用中起著核心作用[8-9]，包括多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases，PGs)、果膠和果膠酸裂解酶(Pectatelyases，PLs)、木聚糖酶(Xylanase)和蛋白酶(Protease)[10]。其中PGs存在于所有真菌基因組中，通常由果膠底物誘導(dǎo)表達，能有效地浸漬植物組織，PG1是果膠生長和番茄植株感染期間尖孢鐮刀菌番茄專化型(F.oxysporum f.sp.lycopersici)分泌的主要內(nèi)生細胞壁降解酶，也是在番茄細胞壁的尖孢鐮刀菌培養(yǎng)物中檢測到的第一個酶[11]，此外，還檢測到了PG2和PG3。外切PGs進一步降解由細胞壁釋放的寡聚半乳糖醛酸。編碼外切PGs的pgx4基因在番茄植物感染期間表達，外切PGS基因pg5在柑橘果膠和植物感染早期的腐生生長過程中表達，但pg5和pgx4的靶向失活不會導(dǎo)致果膠的生長減少或毒力的改變。Ruiz等[12]研究尖孢鐮刀菌番茄?；透腥痉阎仓陼r發(fā)現(xiàn)，在缺乏pg1編碼的內(nèi)切PGs和pgx6基因編碼的外切PGs的雙突變體中，果膠生長期間分泌的PGs活性顯著降低，對番茄植株的毒力也降低。PLs在維管束枯萎病的發(fā)展中也很重要，可以在受感染的番茄根和莖組織內(nèi)檢測到。在疾病周期的不同階段觀察到編碼尖孢鐮刀菌的內(nèi)切PLs的pl1基因的轉(zhuǎn)錄。尖孢鐮刀菌的xyl3基因編碼一種木聚糖酶，催化木聚糖的水解，導(dǎo)致植物細胞壁的降解，xyl3在尖孢鐮刀菌感染的開始直至疾病癥狀出現(xiàn)期間的整個疾病周期都表達[13]。艾聰聰?shù)萚14]發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌胞內(nèi)和胞外蛋白酶活性均較高，尖孢鐮刀菌可能通過分泌蛋白酶來參與對宿主植物的侵染系統(tǒng)。

1.2 毒素

尖孢鐮刀菌在感染過程中分泌與致病相關(guān)的真菌毒素，以促進感染并抑制宿主防御。這些毒素主要是低分子量的次生代謝物，如鐮刀菌酸(Fusaric acid，F(xiàn)A)、伏馬菌素 (Fumonisins，F(xiàn)Bs)、白僵菌素(Beauvericin，BEA)、恩鐮孢菌素(Enniatins，ENs)和單端孢霉烯族毒素（Trichothecenes）等[15]。這些毒素引起植物壞死、萎黃，抑制生長和種子萌發(fā)。FA是導(dǎo)致多種作物枯萎病的原因，誘導(dǎo)植物細胞早期去極化。改變細胞膜滲透性或膜電勢，導(dǎo)致跨膜電位去極化，產(chǎn)生活性氧，影響細胞膜完整型。Tan等[16]表明患病植物中FA的濃度與尖孢鐮刀菌的毒力呈正相關(guān)，Bouizgarne等[17]證明FA在大棗枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.albedinis)感染的早期階段發(fā)揮了重要作用。Wang等[18]研究表明鄰苯二甲酸(Phthalic acid，PA)是蘭州百合根系分泌物中的主要自毒素，通過誘導(dǎo)自毒作用參與土壤病害。PA能夠刺激FA的產(chǎn)生和蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和淀粉酶等水解酶活性的提高，從而促進百合枯萎病的發(fā)展。Wu等[19]報道了肉桂酸、芥子酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸和苯甲酸也能刺激尖孢鐮刀菌西瓜?；?F.oxysporum f.sp.niveum)的FA產(chǎn)生。除此之外，F(xiàn)Bs是聚酮化合物衍生的霉菌毒素，可抑制鞘氨醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶神經(jīng)酰胺合酶[20]。單端孢霉烯族化合物是真核生物中蛋白質(zhì)翻譯的有效抑制劑，抑制植物的生長[21]。BEA和ENs的毒性與它們促進陽離子通過膜運輸?shù)哪芰τ嘘P(guān)，影響細胞的正常生理水平和體內(nèi)離子平衡，細胞內(nèi)陽離子（例如Ca2+）的增加會激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶，并導(dǎo)致隨后的DNA片段化，從而使細胞凋亡[22]。Moretti等[23]研究表明，尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的BEA對被測植物（西瓜、番茄、小麥和大麥）的根部均未引起任何癥狀，但它對所有被測植物的原生質(zhì)體均表現(xiàn)出高毒性。

2 信號傳導(dǎo)與感染進程

尖孢鐮刀菌通過信號刺激啟動特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)模塊處理接收細胞內(nèi)的信號，并將其分配到適當?shù)募毎麅?nèi)靶標。該級聯(lián)的第一個模塊MAPK激酶激酶(MAPKKK)磷酸化并由此激活MAPK激酶(MAPKK)，MAPK激酶又磷酸化并激活MAPK。一旦被激活，MAPK通過磷酸化細胞中的各種蛋白質(zhì)，包括基因調(diào)控蛋白和其他蛋白激酶，將信號傳遞到下游[24]（圖1）。

圖1 尖孢鐮刀菌的MAPK信號傳導(dǎo)途徑

MAPK渠道信息是賦予尖孢鐮刀菌完全毒力所必需的。Fmk1、Mpk1和Hog1是MAPK途徑中的3種關(guān)鍵酶[25]，調(diào)控著尖孢鐮刀菌對宿主的感染進程，如尖孢鐮刀菌與宿主植物根的粘附、穿透、感染菌絲的形成、維管束定植和在活體組織上的侵襲性生長。Fmk1在番茄果實組織浸漬和表面產(chǎn)生氣生菌絲方面也起著重要作用。高度糖基化的跨膜蛋白Msb2與四跨膜蛋白Sho1共同作用于Fmk1上游，使其完全磷酸化，調(diào)節(jié)Fmk1途徑參與植物感染[26]。尖孢鐮刀菌的RHO型GTPase Rho1蛋白是正確組裝細胞壁和毒力所必需的。Rho1蛋白正調(diào)節(jié)葡聚糖合成酶翻譯后的活性，并在維持菌絲結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用，從而阻止其被宿主防御[27]。GTP結(jié)合蛋白是介導(dǎo)細胞對環(huán)境刺激反應(yīng)的重要組分，當細胞外信號分子與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合時，受體構(gòu)象發(fā)生變化，使其能夠激活G蛋白，G蛋白附著于質(zhì)膜的細胞表面，由α、β和γ三個蛋白質(zhì)亞基組成。尖孢鐮刀菌具有編碼Gα蛋白的FGA1和FGA2基因以及編碼Gβ蛋白FGB1的基因，F(xiàn)GA1和FGA2基因調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性，并改變與致病性相關(guān)的cAMP水平[28]，F(xiàn)GA1和FGA2基因的突變體菌株導(dǎo)致致病性降低和菌落形態(tài)改變。

膜蛋白（Sho1和Msb2）與Fmk1共同調(diào)控細胞壁降解酶pl1、chsV、fks1、gas1等基因的表達。Pietro等[29]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mk1基因靶向失活突變體的致病性顯著降低，不能在番茄果實疏水表面產(chǎn)生氣生菌絲，使番茄植株細胞壁的酶降解能力和在果實組織上的侵襲性生長能力均顯著降低，證明MAPK-FMK1是尖孢鐮刀菌侵染菌絲形成、根系附著和穿透以及在活體植物組織上入侵生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一部分。Cristina等[30]研究表明F-box蛋白Fbp1是Fmk1完全磷酸化所必需的，F(xiàn)bp1通過Fmk1途徑調(diào)節(jié)尖孢鐮刀菌的毒力和侵襲性生長，F(xiàn)bp1突變體對十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)過敏，經(jīng)SDS處理后的植物細胞壁完整性提高。

組氨酸激酶Fhk1是通過募集幾種信號傳導(dǎo)途徑促成毒力、氧化應(yīng)激和殺真菌劑敏感性的另一個關(guān)鍵因素。Fhk1調(diào)節(jié)尖孢鐮刀菌穿透宿主植物途徑并增強其疾病癥狀[31]。Fhk1也能通過募集MAPK途徑中Hog1和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)負調(diào)節(jié)劑Fmk1來控制宿主植物的應(yīng)激反應(yīng)。在一些植物病原真菌中，Hog1通過影響有性生殖、附著胞形成和宿主組織的滲透來降低致病性。Pareek等[32]利用基因沉默技術(shù)RNA干擾(RNAi)構(gòu)建尖孢鐮刀菌Fmk1-RNAi和Hog1-RNAi基因工程菌株，研究結(jié)果表明Fmk1-RNAi工程菌株菌落表面疏水性喪失，侵染番茄植株時，侵染力降低，對番茄幼苗的毒力降低，Hog1-RNAi工程菌株的分生孢子大小改變，對番茄植株的侵襲性生長和發(fā)病率降低。

3 毒力的調(diào)控

3.1 毒力控制基因

尖孢鐮刀菌的毒力具有多基因特性，其遺傳調(diào)控是一個復(fù)雜的過程。F.oxysporum 4287的基因組大小為61 Mb，由分布在15條染色體上的17735個基因組成[33]，整個基因組的1/4為特異性表達譜區(qū)域，該區(qū)域富含轉(zhuǎn)座子及與致病相關(guān)的基因，涉及毒力和宿主特化的基因位于致病性染色體上。

尖孢鐮刀菌在番茄木質(zhì)部系統(tǒng)的定殖與SIX(secreted in xylem)家族蛋白質(zhì)的分泌有關(guān)。編碼Six1、Six3、Six5、Six6和Six7的基因以及編碼植物分泌的氧化還原酶的基因都位于14號染色體上，該染色體存在于導(dǎo)致番茄枯萎病的所有致病菌株中，但在無毒菌株中不存在。編碼具有保守F-box基序的蛋白質(zhì)的fRp1基因在尖孢鐮刀菌感染宿主的第一階段起重要作用[34]?；駻RG1（編碼精氨酸琥珀酰酶）、Fow1（編碼線粒體載體蛋白）、Fow2（編碼Zn(II)2Cys6轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）和SNF1（編碼組蛋白激酶）共同促成致病性。此外，Clc1基因（編碼氯離子通道）調(diào)節(jié)尖孢鐮刀菌中的漆酶活性和毒力[35]，真菌漆酶在尖孢鐮刀菌感染過程中也很重要，在植物病原形態(tài)發(fā)生和保護尖孢鐮刀菌抵御宿主防御方面具有重要意義。Velvet蛋白家族復(fù)合物(VeA、VelB、VelC、Lae A)和LaeA也通過促進菌絲生長、無性孢子形成來調(diào)節(jié)尖孢鐮刀菌生長發(fā)育過程，López-Berges等[36]研究表明Velvet蛋白家族復(fù)合物編碼基因veA、velB、velC的缺失對尖孢鐮刀菌菌絲的生長發(fā)育和入侵番茄植株的毒力產(chǎn)生深遠影響，而laeA基因編碼的LaeA在尖孢鐮刀菌番茄?；颓秩痉阎仓旰笃谄鹬P(guān)鍵作用，是在木質(zhì)部導(dǎo)管成功定植和使維管束萎蔫癥狀發(fā)展的關(guān)鍵。

3.2 轉(zhuǎn)錄因子對毒力的影響

毒力在宿主植物細胞中的表達受很多基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。至少有7個系列的轉(zhuǎn)錄因子參與了毒力基因的調(diào)控。

（1）Con7-1調(diào)節(jié)參與許多不同功能基因的表達，包括宿主與病原體之間的相互作用、形態(tài)發(fā)生和發(fā)育、信號感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達的調(diào)節(jié)和細胞代謝。Con7-1具有核定位信號結(jié)合結(jié)構(gòu)域Cys2His2DNA，負責蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的卷曲螺旋區(qū)域和富含脯氨酸/谷氨酰胺的C末端反式激活結(jié)構(gòu)域。調(diào)控內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶等蛋白的表達。Carmen等[37]研究表明Con7-1是尖孢鐮刀菌形態(tài)發(fā)生和毒力的一般調(diào)節(jié)因子，其靶向缺失突變體的形態(tài)發(fā)生明顯改變，且致病性喪失。（2）多拷貝基因ftf1編碼僅存在于高毒力尖孢鐮刀菌菌株中的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控尖孢鐮刀菌早期感染進程中的毒力。該基因推定編碼轉(zhuǎn)錄因子Zn(II)2Cys6，并且首先在菜豆枯萎病原菌(F.oxysporum f.sp.phaseoli)的高毒力菌株中發(fā)現(xiàn)[38]，在尖孢鐮刀菌定殖的植物中富含從ftf1的多個拷貝或其中至少一些拷貝轉(zhuǎn)錄的mRNA，但在真菌培養(yǎng)物中幾乎檢測不到。ftf1轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)與效應(yīng)子編碼基因SIX1和SIX6的最高表達水平相關(guān)，調(diào)控尖孢鐮刀菌侵染宿主植物維管束進程。（3）Sge1基因調(diào)控尖孢鐮刀菌進入宿主植物木質(zhì)部后啟動致病力的SIX蛋白，由Sge1基因編碼的核蛋白Sge1是尖孢鐮刀菌在宿主植物細胞和木質(zhì)部的廣泛生長所必需的。Michielse等[39]發(fā)現(xiàn)，Sge1基因缺失突變株中的鐮刀菌酸、白僵菌素和許多未知代謝物的產(chǎn)生量減少，且枯萎癥狀相對于野生型來說顯著降低。Sge1基因的缺失不影響其營養(yǎng)生長，但能調(diào)節(jié)真菌病原體分生孢子的形成并影響致病性，Sge1基因缺失突變體對宿主植物的穿透和定殖能力受到損害甚至喪失，在活細胞或木質(zhì)部系統(tǒng)中的廣泛生長受到限制，致病性基本喪失，Sge1轉(zhuǎn)錄因子的表達受ftf1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[40-41]。（4）Sge1基因編碼一個同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控Fmk1通路下游的侵襲性生長。（5）XlnR基因編碼木聚糖酶基因xly3、xly4和xyl5的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控植物細胞壁降解酶的表達[42]。（6）基因ctf1和ctf2編碼的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控編碼角質(zhì)酶和脂肪酶的基因的表達[43]。（7）最后，pacC通過結(jié)合通用序列5'-GCCAAG-3'來抑制酸性表達的毒力基因和多聚半乳糖醛酸酶pg1和pg5的表達，從而編碼作為尖孢鐮刀菌毒力的負調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄因子[44-45]。

3.3 小分子RNA對毒力的調(diào)控

尖孢鐮刀菌致病過程中大量高表達的小分子RNA(microRNA-like RNAs，milRNAs)對致病的調(diào)控作用是最近的研究熱點[46-47]，milRNAs是真菌中產(chǎn)生的一類小RNA[48-49]，在病原真菌與植物互作過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。而AGO蛋白是真菌milRNA生物合成過程中的重要蛋白，在香蕉枯萎病菌中，QDE2基因是編碼AGO蛋白的基因之一，林漪蓮等[50]發(fā)現(xiàn)QDE2基因敲除突變體的氣生菌絲、產(chǎn)孢量和致病力與野生型菌株相比均明顯減弱，而在互補轉(zhuǎn)化子中這些表型有所恢復(fù)；QDE2基因敲除突變體的milRNA的表達量明顯下降，在互補轉(zhuǎn)化子中恢復(fù)到野生型水平；說明QDE2基因除了參與部分milRNA的合成外，還影響著病原菌的生長、產(chǎn)孢和對寄主的致病力，這一發(fā)現(xiàn)為尖孢鐮刀菌的致病機理解析提供了新的見解。

4 展望

目前，尖孢鐮刀菌細胞壁降解酶、感染進程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控已取得了重要進展。但由于尖孢鐮刀菌的毒力是由復(fù)雜的多基因控制的，仍然有很多未知基因及毒力調(diào)控機制等待我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。今后可從以下兩個方面開展后續(xù)研究：（1）探索尖孢鐮刀菌致病過程中關(guān)鍵致病因子將為人類開發(fā)更有效的防控策略提供作用靶標。（2）利用蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等技術(shù)對尖孢鐮刀菌的致病機理進一步解析，從而將尖孢鐮刀菌入侵植物的過程、致病性和非致病性種族的蛋白質(zhì)差異、宿主植物抗性和易感品種的蛋白質(zhì)表達的全局變化等將更完整的被呈現(xiàn)出來。

深入探究尖孢鐮刀菌致病機理，將為人類制訂尖孢鐮刀菌病害的綜合防控措施提供更充足的科學依據(jù)，為減少該類病害的發(fā)生奠定理論基礎(chǔ)。