張君超 武冬霞 田秀梅

摘 要：本實驗運用高效液相色譜法對兩種商品化肝素親和柱的柱容量、實際樣本純化效果、重復性及操作便捷性進行了系統(tǒng)性對比，旨在研究兩種商品化肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白的性能，同時為相關用戶提供選擇商品化肝素親和柱的建議。研究結果顯示，兩種肝素親和柱對1mg乳鐵蛋白標準品的回收率為90.8%～95.6%，柱容量均能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測需求;對牛乳及乳粉樣本中乳鐵蛋白的加標回收率為81%～95%，且重復使用3次仍能保持對牛乳及乳粉樣本80%以上的加標回收率，即兩種肝素親和柱對乳及乳制品中乳鐵蛋白均有良好的純化效果且3次內可重復使用。在操作便捷性方面，兩種肝素親和柱在保證檢測結果準確性的前提下，A柱操作簡便、前處理時間短且可同時使用多個A柱檢測多個樣品，B柱則需要手動加壓或使用蠕動泵進行操作，前處理時間較長且無法低成本地同時處理多個樣本。綜上所述，兩種商品化的肝素親和柱均可滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化需求，在操作便捷性方面A柱優(yōu)于B柱，相關用戶可綜合市場、價格等因素選擇合適的產品。

關鍵詞：肝素親和柱? 乳及乳制品? 乳鐵蛋白

1 引言

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是哺乳動物乳汁中富含的一種天然非血紅素鐵結合糖蛋白，且具有強大的生物功能，如抗菌、抗氧化、抗癌、促進腸道發(fā)育和鐵吸收，以及調節(jié)免疫系統(tǒng)等[1-3]。因乳鐵蛋白具有優(yōu)質的生物功能，免疫力低下的人群、患有感染性疾病的人群、具有骨質疏松風險的人群，以及缺鐵性貧血人群均對于乳鐵蛋白的補充有所需求[4]。由于乳鐵蛋白熱穩(wěn)定性差，故加熱過程中會發(fā)生蛋白質變性。一方面，乳鐵蛋白作為生鮮乳中的天然成分，如何更多的保留其天然營養(yǎng)活性已成為巴氏殺菌乳研究領域關注的技術重點，“國家優(yōu)質乳工程”明確提出優(yōu)質巴氏殺菌乳生物活性物質的指標要求——乳鐵蛋白≥25mg/L[5];另一方面，乳鐵蛋白常被作為營養(yǎng)強化劑添加入經高溫工藝生產的乳制品中，如嬰幼兒配方食品和特殊醫(yī)學用途配方食品等，且《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》（GB 14880-2012）中也對乳鐵蛋白的添加量也做了明確規(guī)定，即在乳品中的添加量不超過1.0g/kg[6]。

據報道，乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法有免疫擴散法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測法等免疫學分析法，高效液相色譜法、高效液相-質譜聯(lián)用法/超高效液相-質譜聯(lián)用法、毛細管電泳法、凝膠電泳檢測方法等色譜分析法，以及分光光度法、離子共振法、生物傳感測定法、核酸適配體法等[7-8]，但以上眾多檢驗方法均不是國家強制性標準。在眾多乳鐵蛋白檢測方法中，高效液相色譜法因具有反應靈敏、結果準確、重復性好等優(yōu)點，已被作為團體標準公布實施[9]，同時也被作為食品中乳鐵蛋白測定的國家標準征求意見稿中第一法。但該方法對樣品純度要求較高，且乳粉的基質成分相對復雜，故試樣無法直接進行液相色譜檢測，而需對其進行前處理。目前，常用的前處理方法為肝素親和柱純化乳及乳制品中的乳鐵蛋白。

肝素（Heparin）是一種含硫酸酯的酸性多糖，可通過糖苷鍵與一些結構糖蛋白結合，同時肝素表面的負電荷會與帶正電的蛋白質發(fā)生離子作用。因此，肝素能和抗凝血因子III、凝血酶、類凝血酶、重組人角質細胞生長因子等生物大分子結合。乳鐵蛋白也是一種結構糖蛋白，在合適的緩沖液條件下，乳鐵蛋白與肝素可通過糖苷鍵和離子發(fā)生親和作用，故肝素可用于純化乳及乳制品中的乳鐵蛋白。為方便檢測，需把肝素制作為填料形式：以高流速瓊脂糖微球為基質，采用環(huán)氧活化工藝將肝素偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上。目前，市場上已有商品化的肝素親和柱，但由于各廠家肝素親和柱的生產工藝不盡相同，造成肝素親和柱對乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化效果也有所差異。本實驗對這兩種常見商品化肝素親和柱的柱容量、實際樣本純化效果、重復性及操作便捷性等幾個方面進行系統(tǒng)性對比研究，旨在研究兩種商品化肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白性能，同時為相關用戶提供選擇商品化肝素親和柱的建議。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

2.1.1 儀器

高效液相色譜儀（1260），Agilent;天平（PL602E），梅特勒-托利多;親和柱支架（HMG-QS），北京華安麥科科技有限公司;渦旋混合儀（HMG-WX），北京美正生物科技有限公司;高速冷凍離心機（TG16-W），湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;pH計（PHS-3C），上海儀電科學儀器股份有限公司。

2.1.2 試劑

乳鐵蛋白標準品（純度>95%），北京美正檢測技術有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為優(yōu)級純，乙腈、三氟乙酸均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司;0.45μm水系濾膜，天津津騰實驗設備有限公司;肝素親和柱A（3mL），北京美正生物科技有限公司;肝素親和柱B（1mL），美國通用電氣醫(yī)療集團。

2.2 實驗方法

2.2.1 乳及乳制品中乳鐵蛋白檢測前處理方法

方法一：參照《食品安全國家標準 食品中乳鐵蛋白的測定》征求意見稿中的第一法。

方法二：參照肝素親和柱（北京美正生物科技有限公司）產品說明書。

2.2.2 乳及乳制品中乳鐵蛋白含量測定

使用高效液相色譜法測定經肝素親和柱純化后的試樣中乳鐵蛋白的含量。固定相：C4色譜柱、（250mm×4.6mm×5μm，300?），沃特世科技（上海）有限公司;流動相：A液為0.1%三氟乙酸，B液為乙腈。檢測前以最開始洗脫時的AB流動相配比為準，待基線平穩(wěn)后開始進樣;進樣體積30μL，梯度洗脫程序如表1所示，柱溫30℃，檢測紫外波長280nm;檢測完成后對色譜柱進行維護：進空針，運行梯度洗脫程序，確認色譜柱無乳鐵蛋白洗出后再用甲醇水清洗色譜柱。

試樣中乳鐵蛋白含量計算公式：

式中：X為試樣中乳鐵蛋白含量，mg/g;C為由標準曲線計算得到的乳鐵蛋白檢測濃度，μg/mL;V1為洗脫體積，mL;V2為定容體積，mL;V3為上樣液體積，mL;m為試樣稱樣量，g。

2.2.3 肝素親和柱柱容量對比

肝素親和柱作為乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化工具，柱容量需要滿足常見乳及乳制品的檢測需求。據報道，鮮牛乳中乳鐵蛋白含量約為0.02～0.2g/L，且該成分會隨著加工過程中加熱時間、pH值、鐵飽和度及壓力等因素的變化而降低活性和功能[10-12];《食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑使用標準》（GB 14880-2012）中也規(guī)定了嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白使用不超過1.0g/kg。根據常見乳及乳制品中含量，分別測試兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下對1mg乳鐵蛋白標準品的結合能力，分別平行測定6次，以回收率的平均值和6次測定的相對標準偏差來評價柱容量是否能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測需求。

2.2.4 肝素親和柱純化乳及乳制品效果對比

肝素親和柱應用于乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化，但由于乳及乳制品基質復雜，需要分別通過測試兩種肝素親和柱分別在兩種前處理方法下對液體乳及乳粉的加標回收率來判定其是否能滿足實際樣本檢測需求。以市售某品牌UHT乳為液體乳陰性樣本加標20mg/100g，兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下分別平行測定3次，以平均值計算加標回收率;以市售某品牌嬰兒配方奶粉為乳粉陽性樣本（乳鐵蛋白標示值為50mg/100g）加標60mg/100g，兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下分別平行測定3次，以平均值計算實際檢出占標示值的百分比和加標回收率。

2.2.5 肝素親和柱重復性對比

肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白是利用肝素與乳鐵蛋白的糖苷鍵和離子作用，理論上肝素填料經再生后仍可純化乳鐵蛋白，且肝素親和柱是高效液相色譜法檢測乳及乳制品中乳鐵蛋白的重要耗材，故重復使用可降低檢測成本。本實驗用UHT乳和陰性奶粉樣本做空白本底，在其中分別加標20mg/100g、60mg/100g，使用方法二測定兩種肝素親和柱的加標回收率及使用次數，實驗結果以平行測定3次的平均值計算，每次使用肝素親和柱用結合緩沖液對兩種肝素親和柱進行再生后再進行下一次檢測。

2.2.6 肝素親和柱操作便捷性對比

肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白的操作過程對于整個檢測過程而言十分重要——在保障檢測結果準確性的前提下，便捷的操作過程可有效提高檢測效率。本實驗以實際操作過程對比兩種肝素親和柱的操作便捷性。

3 結果與分析

3.1 肝素親和柱柱容量對比

兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下對1mg乳鐵蛋白標準品的平均回收率及相對標準偏差如表2所示。實驗結果顯示，兩種肝素親和柱對1mg乳鐵蛋白標準品的回收率為90.8%～95.6%，相對標準偏差為0.92%～1.08%。根據實驗結果分析，兩種肝素親和柱的柱容量均能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測需求。

3.2 肝素親和柱純化乳及乳制品效果對比

兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下測定UHT乳加標回收率，嬰幼兒配方奶粉實際檢出占標示值的百分比和加標回收率結果如表3所示。實驗結果顯示，兩種肝素親和柱檢測UHT乳加標回收率在86%～95%范圍內，嬰幼兒配方奶粉加標回收率在81%～92%范圍內。但在嬰幼兒配方奶粉檢測中，兩種肝素親和柱使用方法一的實際檢出僅占標示值的48%～51%，使用方法二的實際檢出占標示值達到110%～113%。結果顯示，由于兩種前處理方法不同造成實際樣本的檢測結果有所差異，與肝素親和柱本身并無相關性。因此，不同前處理方法對樣本的適用性有待進一步確證。

3.3 肝素親和柱重復性對比

使用前處理方法二測定兩種肝素親和柱對UHT乳和空白奶粉樣本的加標回收率和使用次數，結果如圖1和圖2所示。實驗結果表明，兩種肝素親和柱對牛乳和乳粉中乳鐵蛋白的加標回收率并未隨使用次數的增加而明顯降低，回收率均在80%以上。實驗過程中發(fā)現，重復使用肝素親和柱時必須對其充分再生，否則將影響其下次的回收效率。因此，在實際檢測過程中為保障實驗結果建議重復使用次數不超過2次。

3.4 肝素親和柱操作便捷性對比

兩種肝素親和柱中，A為重力柱形式且填料粒徑較大，B為預裝柱形式且填料粒徑小。實際操作過程中，A無需借助外力對上樣液進行過柱且可以同時對多個樣本進行前處理;B則需要手動加壓或使用蠕動泵對上樣液進行過柱，如要同時對多個樣本進行前處理則需增加多個蠕動泵成本。由于A的填料粒徑大造成過柱液體流速相對B較快，前處理過程中每個樣本可以縮短10～20min前處理時間。

4 結論與展望

本實驗對比研究結果顯示，兩種肝素親和柱的柱容量均能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測需求;對牛乳及乳粉樣本的加標回收率在81%～95%范圍內，且重復使用3次仍能保持對牛乳及乳粉樣本80%以上的加標回收率。兩種肝素親和柱在保障檢測結果準確性的前提下，可同時使用多個A柱檢測多個樣品且溶液過柱流速較快，即有效縮短前處理時間;B柱則需要手動加壓或使用蠕動泵無法低成本同時處理多個樣本。綜上所述，兩種肝素親和柱均可以應用于乳及乳制品中乳鐵蛋白純化，純化效果相當，但A柱在操作便捷性上優(yōu)于B柱，使用者可再綜合市場、價格等因素選擇合適的產品。

本研究發(fā)現，兩種肝素親和柱使用不同前處理方法檢測同一種市售嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量差異為62%，即兩種前處理方法不一定適用于所有乳制品，不同前處理方法對不同乳制品樣本的適用性有待進一步研究。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1604302-04）。