中南大學(xué)

生命科學(xué)學(xué)院

湖南 長沙 410013

0 引言

T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）于1965年被發(fā)現(xiàn)，可以催化γ-磷酸從三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）轉(zhuǎn)移到核酸分子的5’-OH末端[1-2]。研究表明T4 PNK活性與核酸的復(fù)制、重組、修復(fù)密切相關(guān)[3-5]。異常T4 PNK行為會抑制由于DNA異常或損傷而引發(fā)的細(xì)胞免疫，從而引起人類患病如Werner綜合癥、Loom’s 綜合癥和Rothmund-Thomson 綜合癥等重大疾病[6]。因此，T4 PNK在開發(fā)藥物、疾病診斷等方面均具有重要現(xiàn)實意義。有關(guān)T4 PNK的研究已經(jīng)引起研究人員的廣泛關(guān)注[7-10]。而發(fā)展檢測T4 PNK 活性的可靠、簡單方法，更是當(dāng)下重要的研究方向之一。

傳統(tǒng)的檢測T4 PNK活性方法有放射自顯影法、放射性同位素32P標(biāo)記法以及聚丙烯酰胺凝膠電泳法等[11-12]。雖然這些方法的精確度較高、檢測豐度較低，但仍然存在一些缺陷，例如操作程序復(fù)雜、費時費力，甚至有潛在的輻射危害，這極大地限制了其應(yīng)用。為克服這些缺點，研究人員提出了電化學(xué)、熒光法、生物發(fā)光法和比色分析法等多種分析技術(shù)用于T4 PNK活性的高靈敏檢測[13-17]。在這些方法中，基于熒光的分析策略因其高靈敏度和操作簡易受到了研究人員的廣泛青睞。Sun N.N.等[18]基于熒光標(biāo)記核酸探針開發(fā)了氧化石墨烯生物傳感平臺，該平臺能用于T4 PNK活性檢測。Tang Z.W.等[19]利用分子信標(biāo)探針和T4 DNA連接酶檢測DNA磷酸化。盡管上述研究人員在DNA磷酸化測定中做出了許多努力，但這些方法主要取決于熒光染料或特定染料標(biāo)記的核酸探針的使用，其中雙標(biāo)記分子信標(biāo)修飾成本較高，樣本穩(wěn)定性較差。由此可見，提高定量檢測T4 PNK活性的靈敏度、優(yōu)化檢測步驟和方法、降低檢測成本等將是研究人員研發(fā)T4 PNK檢測試劑盒時所面臨的挑戰(zhàn)性問題。

近年來，生物傳感技術(shù)不斷發(fā)展，免標(biāo)記型熒光生物傳感器引起了研究人員的廣泛關(guān)注。免標(biāo)記型核酸探針的構(gòu)建避免了繁瑣的標(biāo)記過程及假陽性等不利因素，該探針具有特異性較強(qiáng)、穩(wěn)定性較好，使樣品活性保持時間較長等優(yōu)點，因而在生物傳感領(lǐng)域有很好的應(yīng)用潛力。Zhao H.等[20]基于單鏈納米銅熒光探針和核酸外切酶III（exonuclease III，Exo III）輔助的信號放大策略實現(xiàn)了多聚核苷酸激酶的免標(biāo)記檢測分析。Chen M.J.等[21]基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和G-四鏈體-ThT體系建立了前列腺抗原的免標(biāo)記熒光檢測方法?；谏鲜鲅芯?，本課題組利用功能核酸探針，基于G-四鏈體的熒光轉(zhuǎn)化，發(fā)展了一種對T4 PNK進(jìn)行高靈敏度和特異性檢測的免標(biāo)記熒光法。該方法的成功構(gòu)建可潛在地篩選T4 PNK抑制劑，為藥物發(fā)現(xiàn)和疾病治療提供有力工具。

1 實驗

1.1 材料與試劑

T4 PNK（10 U/μL）、λ核酸外切酶（λexo）均采購自New England Biolabs公司；DNA 探針PNKTb（序列為5′- CCTAACCCTTTTTAGGGTTAGGGT TAGGGTTAGGG -3′）合成純化于Sangon Biological Engineering Technology & Services公司，DNA探針用 Tris-EDTA 緩沖液配備成溶液后置于-20 ℃下保存，待用；TbCl3、ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）均采購自美國Sigma-Aldrich公司；MgCl2采購自Sinopharm Chemical Reagent公司；實驗所用緩沖液均是Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）；實驗所使用的超純水是通過18.25 MΩ·cm-1的Milli-Q凈水系統(tǒng)所獲得。

1.2 實驗儀器

熒光分光光度計，F(xiàn)-2700型，日本高新技術(shù)公司；漩渦振蕩器，MX-E型，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；恒溫水浴鍋，CH1015型，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；微量進(jìn)樣器，瑞士Hamilton公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗原理

圖1闡述了基于 DNA 熒光探針的T4 PNK活性檢測的基本反應(yīng)原理。首先，本課題組設(shè)計了可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA探針PNK-Tb，在發(fā)卡探針3’末端具有一段富含G-的堿基序列（圖中的藍(lán)色結(jié)構(gòu)）。正常情況下，PNK-Tb探針通過形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，使探針3’末端富含G的堿基序列大部分被封閉在發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖部雙鏈中，因此導(dǎo)致與Tb3+結(jié)合形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)減少，最終只能檢測到微弱的熒光信號。當(dāng)加入T4 PNK之后，T4 PNK可在ATP提供磷酸基團(tuán)的情況下，在PNK-Tb探針形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)5’-羥基末端加上磷酸基團(tuán)，轉(zhuǎn)變成5’磷酸化末端，然后在工具酶λexo（一種能夠特異性水解5’磷酸化雙鏈末端的核酸外切酶）的作用下，將發(fā)卡結(jié)構(gòu)5’磷酸化末端水解，從而使發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，釋放出其3’末端富含G的堿基序列，通過與Tb3+結(jié)合使熒光信號提升[22-23]。對比加入T4 PNK前后的熒光變化，可以對T4 PNK活性進(jìn)行定量檢測分析。

圖1 實驗原理圖Fig.1 Schematic illustration for T4 PNK activity detection

彩圖

1.3.2 熒光測定與其信號處理

實驗選用的熒光染料Tb3+的激發(fā)波長為260 nm，發(fā)射波長為545 nm。發(fā)射波長區(qū)間設(shè)置為460～560 nm，激發(fā)狹縫為5.0 nm，發(fā)射狹縫為10.0 nm，測量電壓為700 V。測量時，應(yīng)極其注意玻璃皿的清潔程度。測量體系應(yīng)為100 μL。多次測量，直至觀測到熒光值穩(wěn)定后，取該值作為本輪測量的最終數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)均通過多次重復(fù)試驗（n≥3）。

1.3.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了獲得實驗最佳的靈敏度、節(jié)約試劑用量，本課題組對Mg2+濃度、ATP 濃度、λexo濃度、Tb3+濃度多個核心反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1）Mg2+濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和不同濃度的Mg2+（1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 mmol/L），在 37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，將20 U/mL T4 PNK、1 mmol/L ATP以及8 Uλexo加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入150 μmol/L熒光染料 Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測定。

2）ATP濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和最佳濃度的 Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，分別將20 U/mL T4 PNK、不同濃度的ATP（0.2, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0 mmol/L）以及8 Uλexo加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入150 μmol/L 熒光染料Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測定。

3）λexo 濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和最佳濃度的Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，分別將20 U/mL T4 PNK、最佳濃度的ATP以及不同濃度的λexo（1.0, 5.0, 8.0, 12.0, 16.0 U）加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入150 μmol/L 熒光染料Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測定。

4）Tb3+濃度優(yōu)化

首先，在100 μL Tris-HCl緩沖液（70 mmol/L，pH 8.0）中加入200 nmol/L PNK-Tb 探針和最佳濃度的Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min；然后，分別將20 U/mL T4 PNK、最佳濃度的ATP以及最佳濃度的λexo加入上述反應(yīng)體系中并繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入不同濃度的熒光染料Tb3+（20.0,50.0, 100.0, 200.0, 300.0 μmol/L），常溫下避光反應(yīng)15 min；隨后進(jìn)行熒光測定。

1.3.4 T4 PNK活性分析

本文根據(jù)所測定的最優(yōu)實驗條件，對T4 PNK進(jìn)行定量分析。在100 μL反應(yīng)緩沖液中加入200 nmol/L PNK-Tb探針和最佳濃度Mg2+，在37 ℃水浴反應(yīng)5 min后加入一系列的T4 PNK（0～100 U/mL）；然后，將最佳濃度的ATP、T4 PNK以及λexo加入上述反應(yīng)體系中，繼續(xù)在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入最佳濃度的熒光染料Tb3+，常溫下避光反應(yīng)15 min后進(jìn)行熒光測定。

1.3.5 T4 PNK抑制劑分析

以ADP作為T4 PNK 活性的抑制劑。在100 μL反應(yīng)緩沖液中加入200 nmol/L PNK-Tb探針和10 mmol/L Mg2+，置于37 ℃水浴反應(yīng)5 min后加入50 U/mL T4 PNK；然后，將最佳濃度的ATP、T4 PNK以及λexo加入上述反應(yīng)體系中，并加入一定量的ADP，繼續(xù)置于37 ℃水浴反應(yīng)30 min；最后，加入最佳濃度的熒光染料Tb3+，置于常溫下避光反應(yīng)15 min后進(jìn)行熒光測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化結(jié)果

為了獲得最佳的實驗結(jié)果，本課題組對可能影響檢測性能的條件進(jìn)行了優(yōu)化。其中，Mg2+濃度對發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要作用。ATP為T4 PNK磷酸化反應(yīng)提供磷酸基團(tuán)。λexo可以特異性切割DNA雙鏈磷酸化末端，從而釋放富含G的堿基序列，因此其濃度的變化對切割效率有重要的影響。Tb3+可以與G-四鏈體結(jié)合產(chǎn)生顯著的熒光信號，其濃度的變化直接影響熒光強(qiáng)度?；谏鲜鲆蛩兀谙挛闹袑g2+、ATP、λexo及Tb3+濃度分別進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 Mg2+濃度優(yōu)化

根據(jù)實驗結(jié)果繪制圖2。

圖2 反應(yīng)放大比隨Mg2+濃度變化的曲線圖Fig.2 The effect of the concentration of Mg2+

圖2中，F(xiàn)0為不加T4 PNK的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入T4 PNK后的熒光強(qiáng)度。由圖可知，隨著Mg2+濃度的增強(qiáng)，反應(yīng)效果不斷增大，當(dāng)濃度為10 mmol/L時達(dá)到峰值，繼續(xù)增加Mg2+濃度，反應(yīng)的放大效果反而降低。因此，10 mmol/L是Mg2+的最佳濃度，用于后續(xù)實驗。

2.1.2 ATP濃度優(yōu)化

ATP在本實驗中主要是提供PO43-。ATP濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著ATP濃度增加，反應(yīng)效果逐漸提高，并在ATP濃度為1 mmol/L處達(dá)到最大值，然后隨著ATP濃度的增加，反而會抑制反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致反應(yīng)的放大比例降低。因此，選擇濃度為1 mmol/L的ATP用于之后的反應(yīng)。

圖3 反應(yīng)放大比隨ATP濃度變化的曲線圖Fig.3 The effect of the concentration of ATP

2.1.3 λ exo濃度優(yōu)化

根據(jù)實驗結(jié)果繪制圖4。

圖4 反應(yīng)放大比隨λ exo濃度變化的曲線圖Fig.4 The effect of the concentration of λ exo

由圖4可知，隨著λexo濃度的提高，其切除DNA雙鏈磷酸化末端的作用逐漸增強(qiáng)，在λexo活性達(dá)到8 U時，反應(yīng)的熒光放大比例達(dá)到最大值；但再繼續(xù)提高λexo濃度，反應(yīng)的放大比例反而有所減小，說明高濃度的λexo對該反應(yīng)有一定的抑制效果。因此，將8U的λexo加入反應(yīng)體系，用于后續(xù)實驗。

2.1.4 Tb3+濃度優(yōu)化

Tb3+主要是用來與反應(yīng)生成的G-rich序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生熒光。根據(jù)實驗結(jié)果繪制圖5。由圖可知，隨著Tb3+濃度的增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度的放大比例不斷增大，當(dāng)濃度為200 μmol/L時達(dá)到最大值，繼續(xù)增加Tb3+濃度，反應(yīng)的放大效果反而降低。因此，將濃度為200 μmol/L的Tb3+用于后續(xù)實驗。

圖5 反應(yīng)放大比隨Tb3+濃度變化的曲線圖Fig.5 The effect of the concentration of Tb3+

2.2 T4 PNK的活性分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取得最優(yōu)實驗條件后，本課題組對不同濃度T4 PNK（0, 2, 4, 6, 8, 10, 50, 100 U/mL）活性進(jìn)行了分析。T4 PNK的考察區(qū)間為0～10 U/mL。圖6是不同的DNA聚合酶濃度與反應(yīng)熒光放大倍數(shù)的對應(yīng)關(guān)系。

圖6 T4 PNK濃度與熒光放大倍數(shù)的關(guān)系曲線Fig.6 The relationship of fluorescence magnification to concentration of T4 PNK

由圖6可知，當(dāng)T4 PNK的濃度為0～10 U/mL 時，兩者呈線性關(guān)系，其線性方程式為

Y=109.158 34+11.790 46X，R2=0.997 8。

另外，本實驗的檢測下限為2.0 U/mL。

圖7是不同濃度T4 PNK酶的熒光光譜圖。由圖可知，隨著T4 PNK濃度的增加，同一時間內(nèi)熒光強(qiáng)度增加的量也逐漸增加。因此，通過使用廉價又簡單的熒光染料，本課題組成功地構(gòu)建了一種低成本和高靈敏的DNA聚合酶活性實時監(jiān)測方法。

圖7 不同T4 PNK濃度下的熒光光譜圖Fig.7 Fluorescence intensity of different concentrations of T4 PNK

2.3 T4 PNK特異性分析

為了進(jìn)一步評估本文分析方法的特異性，本實驗選取了4種酶UDG、BSA、EcoRⅠ和ExoⅠ用作特異性實驗分析，結(jié)果如圖8所示。

圖8 特異性分析Fig.8 Selectivity study

由圖8可知，含有UDG、BSA、EcoRⅠ和ExoⅠ的實驗樣品與空白組相比，熒光值沒有明顯變化，這說明4種酶在整個反應(yīng)體系沒有發(fā)揮作用，并不能導(dǎo)致上述反應(yīng)的發(fā)生，而加入T4 PNK的實驗樣品中熒光強(qiáng)度的變化非常明顯?？梢?，本實驗方法對T4 PNK具有良好的選擇特異性。

2.4 T4 PNK 抑制劑的篩選

在藥物篩選上T4 PNK抑制劑分析有著重要意義。ADP是一種常見的T4 PNK抑制劑。本實驗之所以選擇ADP作為模式抑制劑，是因為大量研究表明10 mmol/L以下的ADP對λexo的活性沒有影響。根據(jù)實驗結(jié)果繪制圖9，其中橫坐標(biāo)代表實驗所加ADP的濃度，縱坐標(biāo)代表相對活性。由圖可知，相對活性隨ADP濃度升高而下降，說明抑制效果隨ADP濃度升高而增大，當(dāng)ADP濃度為4 mmol/L時，抑制率可達(dá)到90 %以上，說明ADP作為T4 PNK的抑制劑，具有良好的抑制效果。因此，本文方法能應(yīng)用于T4 PNK抑制劑的篩選，且在小分子藥物篩選甚至生物化學(xué)機(jī)理研究中皆具有應(yīng)用前景，可以為以后生產(chǎn)抑制T4 PNK活性的藥物打下基礎(chǔ)。

圖9 ADP對T4 PNK活性的影響Fig.9 The effect of ADP on T4 PNK activity

3 結(jié)語

T4 PNK是DNA 復(fù)制和損傷修復(fù)中的重要角色。T4 PNK活性異常與許多疾病有關(guān)，因此開發(fā)出一種快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏、操作簡單的檢測方式對T4 PNK活性進(jìn)行檢測并且篩選其抑制劑，對臨床診斷研究以及現(xiàn)代醫(yī)藥研究具有重大意義。因此，本課題組基于免淬滅標(biāo)記熒光探針對T4 PNK的活性進(jìn)行了熒光檢測以及抑制劑分析，創(chuàng)新性地將稀土元素Tb3+應(yīng)用到 T4 PNK活性的檢測中，構(gòu)建并驗證了一種快速地檢測T4 PNK新方法，探究了該實驗方法的最佳實驗條件，同時為該實驗找了合適的抑制劑ADP，使得反應(yīng)可控、高效進(jìn)行。根據(jù)實驗結(jié)果，本課題組繪制了一定濃度范圍內(nèi)的T4 PNK標(biāo)準(zhǔn)曲線，以實現(xiàn)在一定范圍內(nèi)快速測定T4 PNK濃度，為T4 PNK的后續(xù)研究提供一些思考。

本文檢測方法的反應(yīng)時間較短（不超過60 min），所需的試劑價格低廉，在很大程度上降低了實驗檢測成本。因此，該方法在生物藥物開發(fā)以及生物化學(xué)研究中具有良好的應(yīng)用前景。