李楠，閆智超，孫元琳，周素梅

（1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

燕麥?zhǔn)呛瘫究蒲帑湆伲ˋvena）一年生草本植物，我國(guó)的燕麥類型主要為裸燕麥，又稱為莜麥，與皮燕麥相比，裸燕麥籽粒富含β-葡聚糖、蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸[1]。近年來，β-葡聚糖因具有降低膽固醇[2]、預(yù)防心血管疾病[3]、調(diào)節(jié)血糖[4-5]、促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)[6]、增強(qiáng)免疫力[7]等功效而備受關(guān)注。

有研究表明，燕麥β-葡聚糖是由β-（1→3）-D-葡聚糖和β-（1→4）-D-葡聚糖交聯(lián)而成的線性同聚多糖，主要存在于胚乳及糊粉層細(xì)胞壁中[8]。由于品種、生長(zhǎng)氣候及溫度不同[9]，燕麥β-葡聚糖的含量也不同，麩皮中β-葡聚糖的干基含量一般為2.1%～3.9%[1]。目前，有關(guān)燕麥β-葡聚糖的提取及理化性質(zhì)研究主要以燕麥麩皮為原料[10-13]，上述研究忽略了胚乳細(xì)胞壁中的多糖，并且燕麥在磨粉過程中糊粉層難以物理剝離，另外，燕麥全粉是制作燕麥餅干、面包、面條、饅頭等的原料，全粉的品質(zhì)直接決定上述食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，所以測(cè)定燕麥全粉中的β-葡聚糖，對(duì)分析燕麥全粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、了解燕麥β-葡聚糖的含量、理化性質(zhì)及功能特性有重要意義。

本研究以山西高寒地區(qū)裸燕麥全粉為原料，剛果紅法測(cè)定β-葡聚糖的含量，研究不同提取條件對(duì)裸燕麥全粉β-葡聚糖得率的影響，采用響應(yīng)面分析法得出β-葡聚糖的最優(yōu)提取工藝條件，并分析因素與因素之間的相互作用以及各個(gè)因素對(duì)β-葡聚糖得率的影響程度，同時(shí)測(cè)定了β-葡聚糖的持水力、乳化性及乳化穩(wěn)定性，為山西高寒地區(qū)裸燕麥的精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：山西省朔州市山陰縣。

β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；耐高溫α-淀粉酶（酶活≥40 U/mg）：合肥博美生物科技有限公司；剛果紅：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；鹽酸：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（UV 600PC）：上海元析儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（Scientz-18ND）：寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；pH計(jì)（FE20）：梅特勒-托利多儀器有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)（TD5A-WS）：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋（HH-4）：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；中草藥粉碎機(jī)（FW177）：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將裸燕麥粉碎，過50目篩，與75%乙醇按照料液比1∶8（g/mL）在80℃下回流2 h，以除去脂溶性物質(zhì)、游離糖、小分子蛋白等，并滅活內(nèi)源性β-葡聚糖酶，過濾，沉淀于80℃干燥，備用[14]。

1.3.2 工藝流程

裸燕麥全粉→加稀堿提取兩次，收集上清液（4 000 r/min離心15 min）→耐高溫α-淀粉酶除淀粉→等電點(diǎn)法去除蛋白質(zhì)（調(diào)節(jié)pH值至4.5，95℃的水浴下靜置30 min，收集上清液）→醇沉（真空減壓濃縮，緩慢加入乙醇溶液使最終濃度為60%，4℃下靜置20 h，離心收集沉淀）→沉淀復(fù)溶→冷凍干燥得到燕麥β-葡聚糖粗提物。

1.3.3 燕麥β-葡聚糖含量的測(cè)定

參考伏萃翠[15]的方法稍作改動(dòng)，配制濃度為0.2 mg/mL的β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，加去離子水補(bǔ)足至2 mL，然后分別加入4 mL剛果紅溶液，混合搖勻，反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度值。以β-葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定裸燕麥全粉中β-葡聚糖含量時(shí)，將β-葡聚糖粗提物復(fù)溶，測(cè)定方法與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

pH值對(duì)得率的影響：固定液料比18∶1(mL/g)，提取溫度80℃，提取時(shí)間2 h，研究提取液pH值為10.0、10.5、11.0、11.5、12.0 時(shí)對(duì) β-葡聚糖得率的影響。

提取時(shí)間對(duì)得率的影響：固定液料比18∶1（mL/g），提取溫度 80 ℃，pH10.0，研究提取時(shí)間為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h時(shí)對(duì)β-葡聚糖得率的影響。

液料比對(duì)得率的影響：固定提取溫度80℃，提取時(shí)間 2 h，pH 值 10.0，研究液料比為 15∶1、18∶1、21∶1、24∶1、27∶1（mL/g）時(shí)對(duì) β-葡聚糖得率的影響。

提取溫度對(duì)得率的影響：固定液料比18∶1（mL/g），提取時(shí)間 2 h，pH 值 10.0，研究提取溫度為 70、75、80、85、90℃時(shí)對(duì)β-葡聚糖得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 10.0軟件中的Box-Behnken，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見表1。

表1 因素水平Table 1 Factor levels

1.3.6 β-葡聚糖理化性質(zhì)測(cè)定

持水力：稱取0.5 g冷凍干燥后的β-葡聚糖溶于25 mL蒸餾水中，控制溫度20℃，調(diào)節(jié)pH值為7，于50 mL的燒杯中攪拌24 h，4 000 r/min離心10 min，測(cè)濕重[16]。持水力的大小按式（1）計(jì)算。

式中：m1為樣品吸水后質(zhì)量，g；m0為樣品質(zhì)量，g。

乳化性和乳化穩(wěn)定性：配制質(zhì)量濃度為2%的β-葡聚糖溶液100 mL，控制溫度為25℃，調(diào)節(jié)pH值為7，加入100 mL色拉油，在高速分散器中以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速條件下乳化2 min，然后1 300 r/min離心5 min，記錄乳化層體積[17]。乳化性按式（2）計(jì)算。

將上述乳化樣品，在80℃的水浴中保溫25 min，冷卻后于1 300 r/min離心5 min，計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以β-葡聚糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of β-glucan

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH值對(duì)得率的影響

pH值對(duì)得率的影響見圖2。

圖2 pH值對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.2 The effect of pH on the yield of β-glucan

由圖2可知，在試驗(yàn)pH值范圍內(nèi)，得率先增加后降低，當(dāng)pH值為11.0時(shí)，得率最高，為3.45%。裸燕麥β-葡聚糖在堿性溶液中溶解性增加，所以堿性條件有利于β-葡聚糖的提取，使得率增加。當(dāng)堿性過強(qiáng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致部分β-葡聚糖解聚，黏度增大，顏色加深，使得率下降[18]。綜上，pH值選擇11.0。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

提取時(shí)間對(duì)得率的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.3 The effect of time on the yield of β-glucan

由圖3可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，β-葡聚糖得率先升高后下降，提取時(shí)間為2.0 h時(shí)得率最高。分析原因?yàn)棣?葡聚糖的溶出需要一定的時(shí)間才能達(dá)到平衡，在一定時(shí)間內(nèi)，得率會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。而時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致一部分β-葡聚糖重新被吸附，并且長(zhǎng)時(shí)間處于堿性高溫溶液中，β-葡聚糖會(huì)發(fā)生水解，使得率下降[19]。綜上分析，提取時(shí)間選擇2.0 h。

2.2.3 液料比對(duì)得率的影響

液料比對(duì)得率的影響見圖4。

圖4 液料比對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.4 The effect of liquid-to-material ratio on the yield of β-glucan

由圖4可知，隨著液料比的增加β-葡聚糖得率先升高后基本不變，液料比為21∶1（mL/g）時(shí)得率最高。當(dāng)液料比較小時(shí)提取不充分，增加提取液可使細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)濃度差增加，傳質(zhì)推動(dòng)力增強(qiáng)，有利于β-葡聚糖溶出。但液料比過大，會(huì)增加后續(xù)濃縮能耗，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)沒有意義。綜上，液料比選擇21∶1（mL/g）。

2.2.4 提取溫度對(duì)得率的影響

提取溫度對(duì)得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.5 The effect of temperature on the yield of β-glucan

由圖5可知，在70℃～85℃，β-葡聚糖得率隨溫度的升高而增加，超過85℃后得率開始降低。由于溫度升高加快溶液內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)，并且提取液的黏度也會(huì)隨著溫度升高而降低，所以在一定范圍內(nèi)，得率隨著溫度升高而增加。當(dāng)溫度超過一定值時(shí)，其它雜質(zhì)溶出增加，影響β-葡聚糖的溶出，另外，過高溫度也會(huì)導(dǎo)致β-葡聚糖降解[20]，使得率降低。綜上，提取溫度選擇85℃。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表2中最后5項(xiàng)為中心試驗(yàn)，用以估算試驗(yàn)誤差，其余均為析因試驗(yàn)，以β-葡聚糖得率為響應(yīng)值得擬合二次回歸方程。Y=4.33-0.27A-0.19B+0.066C-0.072D+0.23AB+0.24AC-0.22AD+0.38BC-0.03BD+0.045CD-0.78A2-0.62B2-0.63C2-0.87D2。

對(duì)該模型及系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，其結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis

回歸方程模型（P＜0.000 1）極顯著，而失擬項(xiàng)不顯著（P=0.063 1），說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，回歸方程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況良好，試驗(yàn)誤差較小。校正回歸系數(shù)R2Adj=0.917 2＞0.9，表明該模型相關(guān)度良好，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值間有高度相關(guān)性，未知項(xiàng)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，穩(wěn)定性較好。R2=0.958 6，變異系數(shù)C.V.=6.08%?；貧w模型中一次項(xiàng)A（pH值）、B（提取時(shí)間），交互項(xiàng) BC，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)得率影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC、AD對(duì)得率影響顯著（P＜0.05），其余因素不顯著。從各變量F值的大小可以得出：各因素對(duì)裸燕麥全粉β-葡聚糖得率影響大小順序?yàn)閜H值＞提取時(shí)間＞提取溫度＞液料比。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用項(xiàng)等高線圖分析

圖6為各因素兩兩交互作用的等高線圖，其中橢圓的形狀表示兩因素間的交互作用強(qiáng)弱。

圖6 響應(yīng)面兩因素交互作用等高線圖Fig.6 Contour map of interaction between two factors on the response surface

由圖6可以看出，因素B和因素D、因素C和因素D的交互作用等高線最為接近圓形，說明B和D、C和D之間的交互作用不顯著。而因素B和因素C的等高線為橢圓形，最為陡峭，結(jié)合表3方差分析結(jié)果，B和C的交互作用為極顯著。其余因素交互作用的等高線彎曲程度位于中間，結(jié)合表3方差分析結(jié)果，它們之間的交互作用顯著。

2.3.3 提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)回歸模型分析得出提取裸燕麥全粉β-葡聚糖的最優(yōu)工藝參數(shù)：pH 10.896，提取時(shí)間1.897 h，液料比 20.849∶1（mL/g），提取溫度 84.933 ℃，在此條件下β-葡聚糖的得率為4.372%。根據(jù)實(shí)際情況將最優(yōu)工藝條件修正為提取液pH10.9，提取時(shí)間1.9 h，液料比21∶1（mL/g），提取溫度 85 ℃，在該條件下進(jìn)行 3 次平行試驗(yàn)以驗(yàn)證結(jié)果，得出β-葡聚糖的實(shí)際得率為（4.36±0.10）%，與理論值基本吻合，證明該模型能較好地預(yù)測(cè)裸燕麥全粉β-葡聚糖的得率。

2.4 理化性質(zhì)結(jié)果

β-葡聚糖吸水后膨脹，可使人產(chǎn)生飽腹感，防止飲食過量，本試驗(yàn)得出裸燕麥全粉β-葡聚糖的持水力為（2.30±0.04）g/g，即β-葡聚糖吸收水分的質(zhì)量是其本身質(zhì)量的2倍多，因此可以將β-葡聚糖應(yīng)用于功能性食品中。

β-葡聚糖具有一定的乳化性，本試驗(yàn)在溫度25℃，pH7時(shí)，測(cè)得其乳化能力為（87.47±2.10）%，乳化穩(wěn)定性為（91.24±0.50）%。鑒于β-葡聚糖具有較好的持水力和乳化性，可以將其作為穩(wěn)定劑或增稠劑添加在食品中。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出影響裸燕麥全粉β-葡聚糖得率的因素大小順序?yàn)椋簆H值＞提取時(shí)間＞提取溫度＞液料比。β-葡聚糖具有堿溶性，堿性條件有利于其溶出，但是當(dāng)提取液過堿時(shí)，會(huì)使β-葡聚糖糖苷鍵斷裂，使得率下降，所以提取液pH值對(duì)得率的影響最為顯著。通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出提取裸燕麥全粉β-葡聚糖的較優(yōu)工藝條件為提取液pH10.9，提取時(shí)間1.9 h，液料比21∶1（mL/g），提取溫度85℃，在此工藝條件下β-葡聚糖得率為4.36%。

對(duì)最優(yōu)工藝條件下得到的β-葡聚糖進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定，得出當(dāng)溫度20℃，pH值為7時(shí)，持水力為（2.30±0.04）g/g。當(dāng)溫度25℃，pH值為7時(shí)，其乳化能力為（87.47±2.10）%，乳化穩(wěn)定性為（91.24±0.50）%。本研究為β-葡聚糖作為保水劑、穩(wěn)定劑或增稠劑等應(yīng)用于功能性食品提供了理論基礎(chǔ)。