汪穎，焦雨鈴

①中國科學(xué)院大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；②中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 植物基因組學(xué)國家重點實驗室/國家植物基因研究中心(北京)，中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院，北京 100101；③中國科學(xué)院大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，北京 100049

自然界中葉片的形態(tài)千變?nèi)f化，有單葉和復(fù)葉之分：單葉在一個葉柄上只生有一個葉片；復(fù)葉在一個葉柄上生有兩個或更多葉片。相對簡單的單葉的外形還有很多類型。一位植物學(xué)家可以列舉出圓卵形、披針形等十余種單葉葉型。單葉的葉緣可以具有或深或淺的缺刻，例如楓葉。深裂單葉與復(fù)葉有時已經(jīng)難以區(qū)分。復(fù)葉的形態(tài)更為多變。盡管形態(tài)如此多變，它們大多具有扁平化的特征，因而被歸為葉片[1]。

扁平化葉片的出現(xiàn)是進(jìn)化上的一個重要事件[2-3]。對化石研究的結(jié)果表明，植物登陸于4.2億年前的志留紀(jì)晚期。最早的陸生植物只有分枝，沒有葉片，光合作用是由分枝來完成的。在植物登陸后最初的約4 000萬年間，陸地上出現(xiàn)了幾米高的大樹，但是直到距今3.6～4.0億年前的泥盆紀(jì)晚期葉片才出現(xiàn)。葉片的出現(xiàn)伴隨著大氣中90%二氧化碳的固定，極大地改變了地球生態(tài)系統(tǒng)，為其他物種的出現(xiàn)鋪平了道路。

隨著葉片扁平化的形成，葉片兩面產(chǎn)生并呈現(xiàn)差異。如果細(xì)心觀察過植物的葉片，你應(yīng)該可以輕易分辨出葉片的正反兩面：葉片的向陽面(也叫近軸面，即朝向莖的那一面)比較光滑，有比較厚的蠟質(zhì)層，并且顏色更翠綠一些；而相對地，向地面(遠(yuǎn)軸面)就要粗糙一些，角質(zhì)層也薄一些(圖1)。

圖1 葉片的正反兩面往往具有很大的差別

這其實是植物針對自己的生存和生理功能演化出的特征，對于植物的光合作用及蒸騰作用很有好處。葉片近軸面主要的功能是吸收陽光中的能量，進(jìn)行光反應(yīng)，因此葉肉細(xì)胞擁有比較多的葉綠素；相對來說，葉片的遠(yuǎn)軸面就沒有那么多的葉綠素了，而是主要進(jìn)行光合所需的氣體交換，因此葉片背面分布的防止水分散失的角質(zhì)層自然也薄一些，顏色也要淡一些。事實上，光照本身能促進(jìn)葉綠素的合成，在光照不足的地方生長的植物就會因為缺乏葉綠素而變得黃黃的。

1 葉片發(fā)育過程中扁平化的逐步建立

葉片是由莖尖分生組織產(chǎn)生的。莖尖分生組織的中心維持著一團(tuán)干細(xì)胞，在周邊產(chǎn)生器官。在種子植物開花前，莖尖分生組織周邊不斷產(chǎn)生葉片原基(圖2)。葉片原基最初大致為半圓形，但各個方向的生長速率顯著不同。最終形成的葉片具有基-頂軸、中-邊軸和近-遠(yuǎn)軸三個軸向。其中基-頂軸由葉片基部指向葉尖；中-邊軸從葉片中線指向葉緣；近-遠(yuǎn)軸即前面提及的“正反面”，靠近莖尖分生組織一側(cè)為近軸面。

圖2 番茄莖尖分生組織周圍產(chǎn)生葉片原基(修改自[4])。最小的原基稱為 P1，之前發(fā)生的為 P2、P3……。M標(biāo)示莖尖分生組織中心。ad-ab標(biāo)示近-遠(yuǎn)軸，me-la 標(biāo)示中-邊軸。標(biāo)尺為 50 μm

葉原基形成后，三個軸向的生長速率有顯著不同。葉片在近-遠(yuǎn)軸方向的生長速率遠(yuǎn)小于中-邊軸和基-頂軸。以模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)為例(圖3)，近-遠(yuǎn)軸向的細(xì)胞層數(shù)從很早開始就維持在6～7層，直至葉片成熟。中-邊軸和基-頂軸則快速延長，形成葉片。由此可見，葉原基定向生長模式的建立是扁平化葉片形成的關(guān)鍵。

圖3 擬南芥初生葉片原基的橫切面比較。葉片標(biāo)記如圖2。注意葉片近-遠(yuǎn)軸生長有限，遠(yuǎn)小于中-邊軸生長速率。標(biāo)尺為 50 μm

2 葉片扁平化依賴近-遠(yuǎn)軸極性

葉片生長的三個軸向幾乎同時建立，那么它們之間是否有依賴關(guān)系呢？一種檢測方法是打破一個軸向的建立，看看其他軸向是否受影響。

分子遺傳學(xué)技術(shù)是研究生命過程的有力手段。基因可能自發(fā)突變，而人為處理還可以加速突變?；蛲蛔兒笕绻粋€發(fā)育過程出現(xiàn)異常，那么我們就可推斷突變的基因調(diào)控這個發(fā)育過程。通過分子遺傳學(xué)，我們再找出突變的基因，這樣就能把基因和發(fā)育過程對應(yīng)上。這就像拆汽車：當(dāng)汽車的某個零件被卸掉，車燈就不亮了，那么這個零件就是負(fù)責(zé)車燈正常工作的。

利用分子遺傳學(xué)技術(shù)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了很多葉片不能正常扁平化生長的突變體，其中最早研究的是金魚草(Antirrhinum majus L.)中的一個自發(fā)突變體 phantastica (phan)[5]。phan突變體的葉片有一部分異常，呈現(xiàn)變窄、變?yōu)槔葼罨虬魻畋硇?。對這些異常葉片的細(xì)胞形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)一步檢查，研究者發(fā)現(xiàn)葉片趨于遠(yuǎn)軸面化，即葉片的表皮、葉肉、維管束中近軸面區(qū)域細(xì)胞部分或全部顯現(xiàn)出遠(yuǎn)軸面細(xì)胞的特征。與此同時，葉片不能扁平生長，即中-邊軸向發(fā)育被抑制?；诖?，科學(xué)家提出中-邊軸向的建立依賴于近-遠(yuǎn)軸向的正確建立。

更多的突變體研究也支持這個觀點。擬南芥中一系列影響近軸面或遠(yuǎn)軸面發(fā)育的突變體都趨于葉片變窄及形成喇叭葉或棒狀葉，說明葉片扁平生長受到影響[1]。然而，煙草(Nicotiana sylvestris)僅形成中脈區(qū)域，無法產(chǎn)生寬大葉片的lamina1(lam1)突變體仍能維持基本的近-遠(yuǎn)軸向，說明葉片近-遠(yuǎn)軸的建立并不嚴(yán)格依賴中-邊軸向發(fā)育[6]。

3 基因表達(dá)界定葉片各區(qū)域

如前所述，葉片的不同區(qū)域具有不同的形態(tài)特征和生理、生化功能。區(qū)域特異的基因?qū)е铝烁鲄^(qū)域的差異，其中最為重要的有近軸面表達(dá)的HD-ZIP III類轉(zhuǎn)錄因子、遠(yuǎn)軸面表達(dá)的KANADI(KAN)轉(zhuǎn)錄因子以及中間區(qū)表達(dá)的WOX類轉(zhuǎn)錄因子。在擬南芥中，HD-ZIP III類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)于分生組織區(qū)，并在葉原基的近軸面有更強(qiáng)的表達(dá)[1]。編碼HD-ZIPIII類轉(zhuǎn)錄因子的mRNA均被小RNA miR165/166降解[7]。這些小RNA表達(dá)在遠(yuǎn)軸面的表皮，并擴(kuò)散至整個遠(yuǎn)軸面區(qū)域[8-9]。擬南芥中冗余的KAN 轉(zhuǎn)錄因子環(huán)繞莖尖分生組織表達(dá)，并在新形成的葉原基中處于遠(yuǎn)軸面區(qū)域?；铙w成像表明，這兩類基因的表達(dá)在葉原基形成前就已經(jīng)出現(xiàn)，形成了“預(yù)置模式”，葉原基跨兩個區(qū)域形成[10-11]。伴隨葉原基的形成，編碼WOX轉(zhuǎn)錄因子的PRESSED FLOWER(PRS)在近、遠(yuǎn)軸區(qū)域之間開始表達(dá)，界定了中間區(qū)。

在葉片發(fā)育早期，近軸面、中間區(qū)和遠(yuǎn)軸面三個區(qū)域一直維持。近軸面和中間區(qū)有部分重疊，但二者和遠(yuǎn)軸面基本無重疊。中間區(qū)是葉片展開的關(guān)鍵區(qū)域。煙草的lam1突變體正是中間區(qū)表達(dá)的WOX基因發(fā)生了突變[12]。單、雙子葉植物中中間區(qū)表達(dá)的WOX基因突變均會影響葉片的形成，說明該機(jī)制高度保守。因物種而異，中間區(qū)表達(dá)的WOX基因或集中在葉片外緣，或遍布整個葉片的中間區(qū)域。WOX基因促進(jìn)細(xì)胞分裂，為葉片生長提供新的細(xì)胞。在葉片成熟后，WOX基因表達(dá)終止，葉片不再長大[13]。

在近軸面、遠(yuǎn)軸面基因缺失或異位激活的突變體中，WOX的表達(dá)區(qū)域消失或不再出現(xiàn)于葉緣。這從分子水平描述了葉片的中-邊軸發(fā)育依賴于近-遠(yuǎn)軸的建立，同時也提出了問題：WOX的表達(dá)如何被近、遠(yuǎn)軸面的基因調(diào)控？

4 經(jīng)典的植物“外科”實驗

在分子遺傳學(xué)技術(shù)出現(xiàn)之前，發(fā)育生物學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)控葉片展開和近-遠(yuǎn)軸極性建立的線索。我們先從一個經(jīng)典實驗開始。

20世紀(jì)四五十年代，曼徹斯特大學(xué)研究生Ian Sussex以土豆為實驗材料，研究植物莖尖與葉片的關(guān)系。之所以選擇土豆，是因為它不僅容易買到，而且能不斷生芽，人們可以方便地削下帶著芽的土豆塊，修成合適的形狀放在顯微鏡下觀察。

Sussex用手術(shù)刀把即將發(fā)生的葉片原基和莖尖輕輕劃開一個切口，但是讓葉片的其他部位與整體相連(圖4)。幾天后，他發(fā)現(xiàn)那些在近軸面與莖尖分開的葉片無法側(cè)向展開，形成棒狀葉片。通過對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行細(xì)致觀察，他發(fā)現(xiàn)這些棒狀葉片的近-遠(yuǎn)軸極性發(fā)育不正常，葉片各個方向都和遠(yuǎn)軸面相似。此外也有些葉片成為“喇叭葉”，其頂端像喇叭一樣是圓錐形的，喇叭口以下與棒狀葉類似，沒有極性[14-15]。

圖4 Sussex在即將發(fā)生的葉片原基(I1c)和莖尖(A)之間切開一個小口，但是底端仍與整體相連[15]

Sussex由此推測：莖尖的干細(xì)胞產(chǎn)生一個信號，指導(dǎo)葉片近軸面形成；當(dāng)“手術(shù)”切割阻斷這個信號時，默認(rèn)的遠(yuǎn)軸面發(fā)育程序啟動，導(dǎo)致葉片只有遠(yuǎn)軸面發(fā)育。該實驗最后被寫入了發(fā)育生物學(xué)的教科書，而這個信號也因此被稱為“Sussex信號”。

5 一切都指向生長素

Sussex實驗似乎很好地解釋了極性的信號來源，可是對于它到底是由什么物質(zhì)介導(dǎo)，甚至它是否真的存在，一直眾說紛紜。近半個世紀(jì)后，我國許智宏先生課題組的一項研究打破了這一領(lǐng)域的沉寂。該團(tuán)隊在組織培養(yǎng)的白菜、煙草等多種植物中都發(fā)現(xiàn)，加入了生長素的運輸抑制劑能夠誘發(fā)喇叭葉和棒狀葉產(chǎn)生。這說明生長素和它的運輸與葉片極性發(fā)育有關(guān)[16]。

生長素是最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素，其中最重要的化學(xué)物質(zhì)為3-吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)。這種小分子可以由色氨酸合成得到，雖然對人和其他動物沒有什么作用，卻對各種植物的發(fā)育至關(guān)重要，根生長、維管束分化、頂端優(yōu)勢、單性花形成、向光性和向地性等都與它相關(guān)。生長素在植物體內(nèi)的分布很大程度上取決于定向運輸，而定向運輸則依賴于一類稱為PIN的蛋白(圖5)。正是PIN蛋白介導(dǎo)的生長素運輸產(chǎn)生了葉片極性發(fā)育信號。

圖5 在植物體內(nèi)，生長素通過PIN蛋白(綠色)從組織的一端傳遞向另一端(圖片來源：The Plant Cell / Teaching Tools in Plant Biology)

信號分子生長素通過主動運輸在莖尖表皮動態(tài)分布(圖6(a))。葉原基形成的位置就是生長素匯聚的高點。在原基隆起后，原基的近軸面基部與莖尖分生組織間形成了邊界區(qū)，生長素從邊界區(qū)向兩側(cè)分流。我們發(fā)現(xiàn)，擬南芥中葉原基近軸面區(qū)短暫維持低生長素狀態(tài)，而中間區(qū)生長素水平很高。這個生長素的差異分布依賴于PIN1介導(dǎo)的主動運輸。在番茄中局部阻斷從邊界區(qū)運向莖尖分生組織的生長素流能夠模擬手術(shù)切割，獲得不能扁平化生長的棒狀葉、喇叭葉[17]。在近軸面局部施加生長素也會得到和Sussex實驗類似的結(jié)果。由此看來，生長素從葉原基向莖尖分生組織的運輸介導(dǎo)了這個信號，只是運輸方向和Sussex的推測正好相反。

在葉原基兩側(cè)的葉緣處，周邊的PIN1均指向葉原基。黃海老師課題組發(fā)現(xiàn)，在葉緣兩側(cè)同時切口也會導(dǎo)致和Sussex實驗類似的結(jié)果[18]。葉緣正是生長素最為富集的地方。葉原基兩側(cè)的切口很可能也是由于阻斷了生長素的定向運輸，從而影響葉原基內(nèi)部的生長素分布。

前面提到，中-邊軸生長依賴于近-遠(yuǎn)軸的建立，而正是生長素分布和信號介導(dǎo)了這個調(diào)控過程。生長素激活受體，釋放下游轉(zhuǎn)錄因子MONOPTEROS(MP)激活轉(zhuǎn)錄。我們發(fā)現(xiàn)，MP在葉片的近軸面和中間區(qū)均有分布，但在遠(yuǎn)軸面無表達(dá)[19]。PIN1介導(dǎo)的生長素運輸導(dǎo)致生長素在中間區(qū)富集，而近軸面短暫維持了低生長素環(huán)境。在生長素存在的情況下，MP可以直接激活界定中間區(qū)的 WOX 基因表達(dá)。由于生長素和MP分布的差異，WOX只在二者的交集也就是中間區(qū)表達(dá)，促進(jìn)葉緣生長(圖6(b))。

圖6 莖尖生長素運輸方向和生長素介導(dǎo)近-遠(yuǎn)軸界定中間區(qū)。(a)莖尖生長素的運輸方向和分布。P1標(biāo)示第一個葉原基，I1標(biāo)示下一個未形成的葉原基。P1、I1周邊的虛線分別標(biāo)示 Sussex式手術(shù)切割和兩側(cè)手術(shù)切割位置。(b)葉原基縱切顯示三個主要區(qū)域及生長素分布和信號分子分布如何決定中間區(qū)WOX基因表達(dá)

6 應(yīng)力反饋維持扁平化生長

基因的表達(dá)如何調(diào)控三維形態(tài)的變化呢？植物細(xì)胞的生長是細(xì)胞內(nèi)的膨壓與細(xì)胞壁約束相互拮抗的結(jié)果。當(dāng)膨壓一定時，細(xì)胞壁約束弱則細(xì)胞生長快。我們發(fā)現(xiàn)早期葉原基的細(xì)胞壁硬度在近軸面、中間區(qū)和遠(yuǎn)軸面存在差異且隨著發(fā)育快速變化[20]。同時，細(xì)胞壁組分果膠的甲酰酯化程度也一并變化，可能是影響細(xì)胞壁硬度的原因。這些力學(xué)屬性的差異能夠解釋早期葉原基由接近輻射對稱向兩側(cè)對稱的轉(zhuǎn)變。

此后，葉片維持高度定向的生長，在近-遠(yuǎn)軸向幾乎沒有加厚，是扁平葉片形成的關(guān)鍵(圖3)。這種高度定向的生長和細(xì)胞分裂是如何實現(xiàn)的呢？中法合作的研究發(fā)現(xiàn)，葉原基發(fā)育早期的細(xì)胞生長也是高度定向的，以中-邊軸向為主[4]。細(xì)胞的膨壓沒有方向性，因此決定生長的是細(xì)胞壁約束的各向異性。纖維素絲在葉原基細(xì)胞中高度定向排列，與生長方向垂直。纖維素的合成是由沿著微管運動的纖維素酶復(fù)合體完成的[21]。細(xì)胞中微管的排布與纖維素一致，以近-遠(yuǎn)軸向為主。力學(xué)計算表明，兩側(cè)對稱的葉片原基中近-遠(yuǎn)軸向應(yīng)力高于其他方向。微管的排布往往被應(yīng)力所決定，沿主應(yīng)力方向排布。這一系列分子水平的作用鏈組成了一個正反饋環(huán)：初步出現(xiàn)扁平化的葉原基中主應(yīng)力沿近-遠(yuǎn)軸方向，導(dǎo)致微管沿此方向排布；微管指導(dǎo)纖維素絲的合成，使纖維素絲同向排布；纖維素絲的定向排布使細(xì)胞無法在近-遠(yuǎn)軸向進(jìn)一步生長，而是沿著與之垂直的平面生長，使原基更為扁平化；扁平化的原基中主應(yīng)力依舊維持近-遠(yuǎn)軸方向。以上反饋環(huán)的不斷重復(fù)加劇了葉片沿中-邊軸和基-頂軸的扁平化生長(圖7)。

圖7 應(yīng)力反饋使葉片維持扁平化生長[4]

綜上所述，中間區(qū)WOX基因和近、遠(yuǎn)軸面基因的表達(dá)使葉片原基從最初接近輻射對稱的隆起變形為兩側(cè)對稱，而應(yīng)力反饋進(jìn)一步維持高度方向性的生長使葉片展開。

7 葉片起源的應(yīng)力反饋學(xué)說

葉片在進(jìn)化過程中如何形成，一直是科學(xué)家們所熱衷的話題。最初的植物只有不斷分枝的枝條，由嫩枝進(jìn)行光合作用。根據(jù)挖掘出的植物化石，考古學(xué)家 Walter Zimmermann 提出了頂枝學(xué)說(telome theory)[22]。頂枝指二叉分枝軸的頂端部分，可以分為不育頂枝(葉狀枝)和能育頂枝(孢子囊)。頂枝學(xué)說假設(shè)了三步形態(tài)特化，認(rèn)為頂枝通過這些特化過程進(jìn)化為葉片(圖8)。這包括鄰近頂枝變?yōu)椴坏乳L度的“越頂”、鄰近頂枝集中到同一平面的“扁化”，以及鄰近頂枝間形成薄壁的“蹼化”組織。然而這些假設(shè)的形態(tài)特化很難和現(xiàn)存的發(fā)育過程對應(yīng)上，更缺少分子證據(jù)的支持。

圖8 頂枝學(xué)說假設(shè)的主要形態(tài)特化步驟：越頂、扁化和蹼化(修改自[1])

在應(yīng)力反饋調(diào)控葉片扁平化研究的基礎(chǔ)上，我們提出了解釋葉片進(jìn)化的“應(yīng)力反饋學(xué)說”[23]。三維計算模擬表明，應(yīng)力反饋不僅能使扁平化器官維持扁平化生長，還能使枝、根等輻射對稱器官的生長以長軸方向為主[4]。應(yīng)力反饋機(jī)制很可能是保守的機(jī)制，作用于各種植物器官類型。早期登陸的植物產(chǎn)生輻射對稱原基，其在應(yīng)力反饋作用下沿著長軸生長，逐步成為枝條。在進(jìn)化過程中，原基中基因表達(dá)的差異性產(chǎn)生，導(dǎo)致原本輻射對稱的原基呈現(xiàn)初步的扁平化，即兩側(cè)對稱。兩側(cè)對稱一旦產(chǎn)生，就被應(yīng)力反饋放大，通過持續(xù)的扁平化生長形成寬大的葉片(圖9)。隨著地球環(huán)境的變遷和氣孔等其他自身結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，當(dāng)扁平葉片有更好的適應(yīng)性時，就被選擇并保留，替代了原初僅有枝條的早期陸生植物。

圖9 葉片起源的應(yīng)力反饋學(xué)說。(a)扁平葉片進(jìn)化的主要步驟；(b)葉原基由初始形變產(chǎn)生初步扁平化形態(tài)，再由應(yīng)力反饋維持扁平化生長形成葉片(修改自[23])

葉片的扁平化是一個基本的自然現(xiàn)象，在一代又一代植物發(fā)育生物學(xué)家的努力下，它的形成機(jī)制逐步被揭示。生物力學(xué)、數(shù)學(xué)模擬等新的研究方向極大拓展了我們的思路，帶來了新的學(xué)說。隨著生命科學(xué)和其他學(xué)科的突破，我們相信在不遠(yuǎn)的將來，對葉片扁平化的形成機(jī)理的理解會有進(jìn)一步的加深和完善。