王雪霖，曹秀梅，閆建設(shè)?

①上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；②上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis, GA)是由單鈉尿酸鹽(monosodium urate, MSU)晶體沉積引發(fā)的炎癥性疾病[1]。當(dāng)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的尿酸濃度超過尿酸的溶解度達(dá)到過飽和狀態(tài)時(shí)，MSU晶體會(huì)在軟骨、滑膜及周圍組織沉積并刺激關(guān)節(jié)滑膜，發(fā)生一系列病理反應(yīng)，從而引發(fā)關(guān)節(jié)處出現(xiàn)急性炎癥[2]。此時(shí)，血管內(nèi)皮表面的黏附分子會(huì)捕獲循環(huán)血中的中性粒細(xì)胞，滲出血管，定向遷移至關(guān)節(jié)腔的炎癥部位，識(shí)別并對(duì)抗入侵宿主體內(nèi)的病原體，發(fā)揮保護(hù)作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，除了吞噬及脫顆粒作用外，中性粒細(xì)胞也可以通過形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)的方式消滅入侵的病原微生物[4]。NETs由于吞噬刺激從中性粒細(xì)胞釋放的胞外DNA纖維，幫助嗜中性粒細(xì)胞固定并誘捕細(xì)菌、真菌或病毒，從而更有效地消除這些病原體[5]。Brinkmann等人[6]率先發(fā)現(xiàn)NETs，他們通過免疫熒光及DNA染料染色的方法對(duì)NETs的組成進(jìn)行分析后得出，該結(jié)構(gòu)是由染色質(zhì)和蛋白顆粒組成的、能捕獲并殺死微生物的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。MSU晶體誘發(fā)中性粒細(xì)胞NETs產(chǎn)生，后者反過來吞噬捕獲MSU晶體，并通過鑲嵌在NETs上的彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、組織蛋白酶G等酶類的殺菌作用，發(fā)揮其抗菌作用，防止炎癥擴(kuò)散[7]。

鑒于中性粒細(xì)胞NETs在GA中發(fā)揮的重要作用，本文將對(duì)GA的發(fā)生、發(fā)展及炎癥消散過程進(jìn)行概述，重點(diǎn)討論中性粒細(xì)胞NETs在GA中所起到的雙重作用，并對(duì)GA中參與中性粒細(xì)胞NETs形成的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行簡(jiǎn)述。

1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎

1.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生及自我緩解

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)作過程主要包括急性炎癥反應(yīng)和炎癥自行消散兩個(gè)階段。痛風(fēng)是由關(guān)節(jié)內(nèi)和關(guān)節(jié)周圍沉積的MSU晶體引發(fā)的、具有典型急性炎癥特征的疾病，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、紅斑和功能喪失。當(dāng)血尿酸濃度超過正常閾值(成年男性237.9～356.9 μmol/L，女性178.4～297.4 μmol/L)時(shí)，機(jī)體會(huì)形成高尿酸血癥。部分患者體內(nèi)過量的尿酸以晶體形式析出并沉積于關(guān)節(jié)滑膜、軟骨以及周圍其他組織，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)GA。GA的一個(gè)顯著特征是其具有“自限性”，患者即使未經(jīng)治療，且在其炎性部位仍然可以檢測(cè)到MSU的情況下，其癥狀亦可在7至10天內(nèi)得到緩解。在關(guān)節(jié)處沉積的MSU晶體破壞了機(jī)體正常穩(wěn)態(tài)平衡，引發(fā)炎癥反應(yīng)。機(jī)體為維持原有穩(wěn)態(tài)會(huì)調(diào)動(dòng)自身免疫應(yīng)答機(jī)制，包括中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs對(duì)晶體進(jìn)行包埋，暫時(shí)性抑制炎癥擴(kuò)散[8]。

1.2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)病理機(jī)制

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者滑液和關(guān)節(jié)周圍的MSU晶體被先天免疫系統(tǒng)識(shí)別為異物，引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。MSU晶體激活單核巨噬細(xì)胞中Toll樣受體(TLR)和NALP3炎性小體的功能[9]，隨后活化半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)。后者將已經(jīng)存在于細(xì)胞中的白介素-1β(IL-1β)的無活性前體和白介素-8(IL-8)轉(zhuǎn)化為有活性的成熟細(xì)胞因子，并迅速釋放至胞外[2]。研究表明，IL-1β和IL-8激活一些促炎相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括NF-κB和MAPK通路。其中，NF-κB不僅能夠影響促炎細(xì)胞因子(比如IL-1、IL-18)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和其他炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，還會(huì)影響粒細(xì)胞趨化因子(IL-8)的轉(zhuǎn)錄[10]。促炎因子和細(xì)胞趨化因子的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)加劇[1]，產(chǎn)生痛風(fēng)發(fā)病中的炎癥放大效應(yīng)(圖1)。

圖1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎自限性的形成機(jī)制存在多種假說。有研究指出，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作早期，肥大細(xì)胞(mast cell, MC)與巨噬細(xì)胞早于中性粒細(xì)胞活化，并釋放前列腺素、組胺等多種細(xì)胞因子和趨化因子刺激腺體分泌、增加毛細(xì)血管通透性，利于中性粒細(xì)胞通過毛細(xì)血管壁遷移至炎癥部位。當(dāng)大量中性粒細(xì)胞在關(guān)節(jié)處聚集時(shí)，可通過釋放胞外誘捕網(wǎng)對(duì)晶體進(jìn)行吞噬包埋，減緩炎癥進(jìn)程，使得炎癥暫時(shí)消散[11]。還有研究指出，在痛風(fēng)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的NLRP3炎癥小體活化需要上游胞質(zhì)蛋白、下游caspase-1前體以及銜接蛋白ASC激活，一些胞內(nèi)炎癥小體調(diào)節(jié)劑(如COPs、POPs等)可通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活性，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合銜接蛋白ASC，阻斷成熟IL-1β釋放，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生[12]。此外，也有研究指出，內(nèi)源性IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)通過競(jìng)爭(zhēng)IL-1受體，阻斷由MSU晶體刺激免疫細(xì)胞釋放的IL-1促炎活性，抑制炎癥反應(yīng)[8]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中炎癥消散能夠抑制輻射性炎癥發(fā)生，是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)所進(jìn)行的自我調(diào)節(jié)過程。

2 中性粒細(xì)胞NETs在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的雙重作用

2.1 中性粒細(xì)胞NETs促進(jìn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)

在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中，MSU晶體刺激產(chǎn)生的大量IL-1β在與中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞受體結(jié)合之后，對(duì)接頭蛋白MyD88進(jìn)行激活。Liu-Bryan等人[13]的研究表明，單核細(xì)胞中表達(dá)的TLR- 2、TLR-4和它們共享的接頭蛋白MyD88是促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化、啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)主要的決定因素之一。MyD88蛋白的激活引發(fā)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，NF-κB又能引發(fā)與炎癥免疫反應(yīng)中密切相關(guān)的炎癥因子(如IL-8、TNF-α)以及一些刺激炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的酶(如環(huán)氧合酶-2(COX-2)、磷脂酶等)表達(dá)，誘使眾多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)至關(guān)節(jié)處使炎癥反應(yīng)加劇[14]。中性粒細(xì)胞被大量募集至關(guān)節(jié)處時(shí)，通過產(chǎn)生NETs這一胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)揮其功能。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中MSU晶體在組織和關(guān)節(jié)處沉積是引發(fā)炎癥部位NETs形成的主要原因。中性粒細(xì)胞在對(duì)MSU晶體攝取的同時(shí)，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞會(huì)釋放更多促炎細(xì)胞因子和趨化因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[15]。

2.2 中性粒細(xì)胞NETs抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)

Mitroulis等人[16]的研究首次發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞NETs在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥消散中具有重要作用。隨后他們發(fā)現(xiàn)在使用IL-1抑制劑處理后，中性粒細(xì)胞形成NETs的能力會(huì)明顯下降，表明NETs形成過程與IL-1的激活有密切關(guān)系[17]。此外，中性粒細(xì)胞對(duì)MSU晶體的攝取導(dǎo)致自身釋放大量細(xì)胞因子，包括炎癥介質(zhì)(如TNF-α和IL-6)、中性粒細(xì)胞引誘劑(如IL-8)和激活劑(如CCL3和CXCL10)，引發(fā)NETs大量形成聚集型NET(aggregated NET, aggNET)。aggNET通過降解細(xì)胞因子和趨化因子并破壞嗜中性粒細(xì)胞的募集和活化，促進(jìn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥消退[18]。由此可見，NETs形成在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥消散中起著至關(guān)重要的作用。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)展至晚期，會(huì)在關(guān)節(jié)等處出現(xiàn)痛風(fēng)石。痛風(fēng)石會(huì)逐漸浸入到骨質(zhì)中，這是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)處出現(xiàn)骨破壞的主要原因[19]。研究表明，痛風(fēng)石的組成成分和NETs十分相似。在顯微鏡下觀察，痛風(fēng)石表現(xiàn)為慢性肉芽腫性損害，主要包括由致密結(jié)締組織圍繞尿酸單鈉化合物晶體為核心所形成的單核/多核巨噬細(xì)胞集合物[20]。當(dāng)發(fā)炎部位出現(xiàn)中性粒細(xì)胞密度很高的情況時(shí)，NETs形成的聚集體aggNET會(huì)密集地包裹MSU晶體，通過自身所含蛋白酶捕獲并降解一些促炎介質(zhì)。Chatfield等人[21]的研究表明NETs在痛風(fēng)的急性炎癥以及未發(fā)炎的痛風(fēng)石周圍都存在，且其對(duì)DNase具有一定抗性，因而在組織中它可通過由DNA包覆的聚集體將晶體隔離，并對(duì)發(fā)生的炎癥反應(yīng)進(jìn)行抑制。研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)石中同時(shí)存在抗炎因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)和促炎因子例如IL-1的表達(dá)，導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中存在慢性炎癥周期，癥狀為不斷反復(fù)發(fā)作和自我緩解[22]。

由此可見，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中中性粒細(xì)胞NETs的形成具有雙重作用：一方面，NETs形成過多造成聚集后，就易形成痛風(fēng)石造成骨質(zhì)侵蝕并誘發(fā)機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)；另一方面，NETs能夠?qū)SU晶體進(jìn)行包埋和清理，保護(hù)機(jī)體。

3 調(diào)控痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中NETs形成的相關(guān)信號(hào)通路

在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中，MSU 晶體在關(guān)節(jié)組織處沉積會(huì)引起關(guān)節(jié)處的免疫細(xì)胞釋放一些促炎性的細(xì)胞因子和趨化因子(如IL-1β、TNF-α、IL-8等)，進(jìn)而誘導(dǎo)大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)至關(guān)節(jié)腔，刺激中性粒細(xì)胞激活，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。近年的研究表明，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制受許多因素，例如一些信號(hào)通路(ERK1/2、p38 MAPK)、信號(hào)傳導(dǎo)(炎性細(xì)胞因子及Src家族PTK)等影響。MSU晶體通過Src家族的PTK信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)單核巨嗜細(xì)胞中IL-8啟動(dòng)子的活化和IL-8的表達(dá)[23]。在IL-8、IL-1β等炎性細(xì)胞因子的作用下，中性粒細(xì)胞大量募集，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。此外，MSU晶體也誘使補(bǔ)體激活，通過產(chǎn)生具有趨化作用的C5a促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，從而影響痛風(fēng)性炎癥反應(yīng)[24]。大量研究顯示，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到關(guān)節(jié)腔所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制的核心，下文就IL-8和IL-1β對(duì)中性粒細(xì)胞趨化性及NETs形成的影響進(jìn)行討論。

3.1 IL-1β信號(hào)通路

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有許多與中性粒細(xì)胞NETs形成相關(guān)的炎性細(xì)胞因子及信號(hào)通路參與調(diào)控。研究表明，IL-1β信號(hào)通路對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中NETs的形成具有重要作用。IL-1β具有多種功能，它是炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理活動(dòng)[17]。IL-1β產(chǎn)生至少受到兩個(gè)不同步驟的嚴(yán)格控制：首先，IL-1β蛋白前體的產(chǎn)生，當(dāng)MSU晶體作為一種異物被細(xì)胞表面和胞質(zhì)模式識(shí)別受體(TLR2、TLR4、CD14等分子)識(shí)別后，引發(fā)巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的激活，促進(jìn)IL-1β前體生成[25]；隨后，對(duì)IL-1β前體進(jìn)行切割以產(chǎn)生具有活性的IL-1β蛋白，對(duì)IL-1β前體的加工涉及到上游信號(hào)caspase-1的激活，有活性的caspase-1能夠?qū)ζ浼庸ぜ羟衃9]。caspase-1的激活需要上游NALP3炎性體激活，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中通過沉積的MSU晶體對(duì)NALP3炎性體激活，從而誘導(dǎo)IL-1β釋放(圖2)[25]。NLRP3廣泛表達(dá)于樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，具有識(shí)別病原體的功能。ASC是NLRP3炎性體中的銜接蛋白，將NLRP3炎性小體和caspase-1前體聯(lián)系起來，形成具有酶活性的異二聚體caspase-1?；罨难仔泽w效應(yīng)蛋白caspase-1，將無活性的IL-18和IL-1β前體剪切為成熟的IL-18和IL-1β并釋放到細(xì)胞外。IL-1β與滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的IL-1β受體相互識(shí)別，激活接頭蛋白MyD88，使NF-κB功能激活，引發(fā)炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)，產(chǎn)生包括IL-1、IL-6、TNF-α和中性粒細(xì)胞的趨化因子等，促使中性粒細(xì)胞進(jìn)入晶體沉積部位發(fā)揮免疫功能，并形成胞外誘捕網(wǎng)吞噬MSU晶體[26]。

圖2 MSU結(jié)晶誘導(dǎo)IL-1β及IL-8表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[25]

3.2 IL-8信號(hào)通路

IL-8是CXC趨化因子家族的成員，是中性粒細(xì)胞趨化因子之一，可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞分泌[27]。在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中，大量中性粒細(xì)胞聚集在關(guān)節(jié)處形成NETs參與炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致發(fā)病的因素之一。體外MSU晶體誘導(dǎo)的單核細(xì)胞模型中，中性粒細(xì)胞大部分趨化活性來自IL-8[28]。IL-8通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化，從而影響中性粒細(xì)胞在關(guān)節(jié)處的募集，影響痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)進(jìn)程。在MSU晶體刺激下，Src家族酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通過刺激IKK/IκB信號(hào)通路，引發(fā)NF-κB活化誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)(圖2)[23]。此外，IL-8在激活嗜中性粒細(xì)胞后，引起基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)家族MMP-9和MMP-2從滑膜組織迅速釋放，兩者可在病理?xiàng)l件下分解與組織破壞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)處的炎癥反應(yīng)[29]。由此可見，IL-8在MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因而抑制IL-8的釋放可能為治療該疾病提供一種新的思路。

4 小結(jié)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由關(guān)節(jié)內(nèi)和關(guān)節(jié)周圍結(jié)晶的MSU晶體引發(fā)，進(jìn)而形成具有典型特征的急性炎癥。中性粒細(xì)胞NETs作為不同于壞死和凋亡的一種新型細(xì)胞死亡方式，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。一方面，機(jī)體在受到MSU晶體刺激時(shí)，引發(fā)中性粒細(xì)胞在關(guān)節(jié)處大量浸潤(rùn)，釋放NETs結(jié)構(gòu)并促進(jìn)炎癥因子分泌，進(jìn)一步推動(dòng)炎癥反應(yīng)進(jìn)程；另一方面，NETs形成有利于機(jī)體對(duì)MSU晶體的清除和炎癥消除，暫時(shí)抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)程。因此，中性粒細(xì)胞NETs的形成是一把“雙刃劍”，如果形成過多而未及時(shí)清除，這種富含各種蛋白水解酶和核酸結(jié)構(gòu)的膠質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠直接引起關(guān)節(jié)處的組織損傷，同時(shí)也可誘發(fā)無菌性炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱、持續(xù)時(shí)間及性質(zhì)受到體內(nèi)各個(gè)免疫環(huán)節(jié)嚴(yán)密調(diào)控，合理地平衡體內(nèi)產(chǎn)生和清除NETs的能力對(duì)促進(jìn)關(guān)節(jié)處炎癥的自行消散過程是十分有益的。機(jī)體內(nèi)的促炎過程與抗炎過程之間既相互聯(lián)系又相互制約[30]，因此要合理研發(fā)既能促進(jìn)自行消散又能防止炎癥進(jìn)一步擴(kuò)大的藥物，這為今后痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供一個(gè)新的思路。