霍鑫 曹治婷 蔡許超

[摘要] 目的 分析下肢動脈硬化閉塞癥（LEASO）患者不同階段熱休克蛋白70（HSP70）及其磷酸化水平的差異及其臨床意義。 方法 收集2017年9月至2019年12月在柳州市人民醫(yī)院收治的80例下肢動脈硬化閉塞癥（LEASO）患者的血樣，按踝肱指數(shù)（ABI）分為A組（ABI≤0.430）和B組（ABI>0.430）。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定本院患者各階段HSP70的表達，分析兩組HSP70濃度及ABI的差異。同時采集4例正常股動脈標本（正常組）和4例動脈粥樣硬化性股動脈標本（病變組），用免疫印跡法檢測HSP70及其磷酸化HSP70（Ser15）、磷酸化HSP70（Ser78）和磷酸化HSP70（Ser82）。對正常組與病變組的蛋白表達水平進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 A組HSP70濃度為（46.731±12.986）ng/mL，ABI為（0.231±0.056）。B組HSP70濃度為（67.104±18.262）ng/mL，ABI為（0.622±0.065）。正常組HSP70蛋白表達及磷酸化水平分別為（0.812±0.131） ng/mL、（0.643±0.107） ng/mL、（0.918±0.206） ng/mL和（0.891±0.168） ng/mL;病變組蛋白表達分別為（0.463±0.072） ng/mL、（0.424±0.081） ng/mL、（0.393±0.065） ng/mL和（0.572±0.101） ng/mL，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 血清HSP70濃度與LEASO嚴重程度呈負相關(guān)，而HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)。病變組HSP70含量及其磷酸化水平明顯低于正常組，可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 下肢動脈硬化閉塞癥;熱休克蛋白70;磷酸化;踝肱指數(shù)

[中圖分類號] R543.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）07-0062-04

Expression and clinical significance of HSP70 and its phosphorylation in arteriosclerosis obliterans of lower extremities

HUO Xin1? ?CAO Zhiting2? ?CAI Xuchao3

1.Department of Vascular Surgery，Liuzhou People′s Hospital in Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou? ?545005， China; 2.Department of Radiology，Liuzhou People′s Hospital in Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou? ?545005，China; 3.Department of Vascular Surgery， Hangzhou Geriatric Hospital， Hangzhou? ?310022， China

[Abstract] Objective To analyze the differences in heat shock protein 70（HSP70）and its phosphorylation levels in patients with lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO） at different stages， and its clinical significance. Methods Blood samples of 80 patients with lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO） who were admitted to Liuzhou People′s Hospital from September 2017 to December 2019 were collected and divided into group A （ABI≤0.430） and group B （ABI>0.430） according to the ankle-brachial index （ABI）. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine the expression of HSP70 in patients in our hospital at various stages. The differences in HSP70 concentration and ABI between the two groups were analyzed. At the same time， four normal femoral artery specimens（normal group） and four atherosclerotic femoral artery specimens（pathological group） were collected. The HSP70 and its phosphorylated HSP70（Ser15）， phosphorylated HSP70（Ser78） and phosphorylated HSP70 （Ser82） were detected by Western blotting. The protein levels of the normal group and the diseased group were statistically analyzed. Results The concentration of HSP70 in group A was（46.731±12.986）ng/mL， and the ABI was （0.231±0.056）. The concentration of HSP70 in group B was（67.104±18.262）ng/mL， and the ABI was （0.622±0.065）. The protein expression and phosphorylation level of HSP70 in the normal group were （0.812±0.131）ng/mL， （0.643±0.107）ng/mL， （0.918±0.206）ng/mL and （0.891±0.168） ng/mL， respectively. The protein expression and phosphorylation level of HSP70 in the pathological group was（0.463±0.072）ng/mL， （0.424±0.081）ng/mL， （0.393±0.065）ng/mL and（0.572±0.101）ng/mL， there was significant difference between the two groups（P<0.05）. Conclusion Serum HSP70 concentration is negatively correlated with LEASO severity， while HSP70 concentration is positively correlated with ABI value. The HSP70 content and phosphorylation level of the diseased group is significantly lower than that of the normal group，which may be closely related to the occurrence and development of atherosclerosis.

[Key words] Lower extremity arteriosclerosis obliterans; Heat shock protein 70; Phosphorylation; Ankle-brachial index

動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心、腦、四肢缺血的主要心血管疾病，嚴重者可導(dǎo)致梗死。動脈粥樣硬化已成為威脅人類健康的第一大殺手和世界上人類死亡的主要原因[1]。下肢動脈硬化閉塞癥（Lower extremity arteriosclerosis obliterans，LEASO）是一種慢性進行性疾病，其表現(xiàn)為動脈粥樣硬化，使下肢動脈內(nèi)膜增厚，管腔變窄甚至閉塞，進而導(dǎo)致患肢間歇性跛行、靜息痛甚至潰瘍等一系列癥狀和體征壞死。動脈粥樣硬化，尤其是LEASO，是一個復(fù)雜的炎癥過程，是冠狀動脈疾病的主要潛在原因。目前對下肢動脈粥樣硬化閉塞癥發(fā)病機制的研究表明，內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的早期事件，與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展密切相關(guān)[2]。

熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）是機體重要的應(yīng)激保護蛋白，廣泛分布于各種組織和細胞中，在受到熱、氧化應(yīng)激或毒物刺激后迅速大量表達。熱休克蛋白按分子量可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱休克蛋白家族。HSP70是一種磷酸化熱休克蛋白，其是熱休克蛋白家族的一員[3]，在人冠狀動脈中的表達模式與斑塊負荷呈負相關(guān)。

HSP70的表達在動脈粥樣硬化過程中可能降低，正常動脈和動脈粥樣硬化斑塊的培養(yǎng)表明，HSP70在正常動脈中的含量較高[3]。股動脈閉塞組與正常股動脈造影結(jié)果比較，其HSP70表達明顯低于正常股動脈硬化組。同時發(fā)現(xiàn)復(fù)合動脈粥樣硬化斑塊中HSP70的表達較低，動脈粥樣硬化患者血清HSP70水平明顯低于健康對照組，提示血清HSP70水平可作為評價動脈粥樣硬化嚴重程度的指標[4]。此外，差異蛋白質(zhì)組學研究表明，不穩(wěn)定斑塊的HSP70較穩(wěn)定斑塊顯著降低，提示HSP70在炎癥和氧化應(yīng)激中起重要作用，這可能與斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)[5]。較高的HSP70水平可以預(yù)測心臟病發(fā)作、中風或降低心血管疾病死亡的風險[6]。此外，增加HSP70的含量可以減輕實驗性動脈粥樣硬化，減輕炎癥，降低膽固醇水平，血漿HSP70水平可能是動脈粥樣硬化的潛在指標[7]，血清HSP70水平可能是動脈粥樣硬化的潛在治療靶點[8]。然而，目前尚不清楚HSP70及其磷酸化位點在疾病不同階段的表達差異及其作用。本研究的目的是進一步闡明HSP70在不同類型和不同分期的LEASO患者中的表達差異及其磷酸化。此外，本研究旨在探討其在LEASO發(fā)揮的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月至2019年12月柳州市人民醫(yī)院80例LEASO患者未經(jīng)手術(shù)治療的臨床資料。LEASO 80例，因病截肢4例，創(chuàng)傷性截肢4例。所有參與者在研究開始前給予知情同意，本研究獲得柳州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。采集空腹血樣。Fontaine分期：Ⅰ期，無癥狀7例;Ⅱa期，輕度間歇性跛行18例;Ⅱb期，中度至重度間歇性跛行24例;Ⅲ期，缺血性靜息27例;Ⅳ期，潰瘍及壞疽4例。根據(jù)踝肱指數(shù)（Ankle brachial index，ABI），將80例患者分為A組（ABI≤0.430）和B組（ABI>0.430），每組各40例。A組男35例，女5例，年齡40～65歲;B組男37例，女3例，年齡41～67歲。8例截肢患者中4例為外傷患者（正常組），4例為動脈粥樣硬化患者（病變組）。采集股動脈標本。正常組男3例，女1例，年齡38～65歲，因外傷不能保留患肢;病變組男2例，女2例，年齡43～70歲，均為壞疽，手術(shù)治療無效。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）? 從我院快速采集血液樣本，并在4℃下保持8～12 h。之后，從血液樣本中分離血清，并保存于-20℃下以供進一步研究。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國紐約創(chuàng)新診斷公司），根據(jù)制造商的方案檢測80例LEASO患者血樣中HSP70。

1.2.2免疫印跡法? 通過添加Sigma從血樣中分離總蛋白。蛋白質(zhì)提取液用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)染到PVDF膜（微孔膜）上。用5%（w/v）試劑級脫脂乳封閉膜，并用主要抗體[包括HSP70（ab12351）、磷酸化HSP70（Ser15）（CST，2406T）、磷酸化HSP70（Ser78）（CST，2215）和磷酸化HSP70（Ser82）（CST，2435）]在4℃下培養(yǎng)過夜，然后進行二級抗體培養(yǎng)。蛋白質(zhì)條帶用CLARITYTM Western ECL底物（Bio-Rad）顯示。

1.3 觀察指標

對HSP70濃度與ABI和Fontaine分期進行相關(guān)性分析。此外，還對4例正常股動脈標本（正常組）和4例動脈粥樣硬化性股動脈標本（病變組）中HSP70和磷酸化HSP70（Ser15）、磷酸化HSP70（Ser78）和磷酸化HSP70（Ser82）的表達進行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計數(shù)資料以[n（%）] 表示，采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Fontaine分期與ABI和HSP70濃度的相關(guān)性

在80例LEASO患者中，F(xiàn)ontaine分期[1]中Ⅱa期、Ⅱb期、Ⅲ期、Ⅳ期HSP70濃度均與Ⅰ期比較，F(xiàn)ontaine分期越晚，HSP70濃度越低，ABI也同樣，均呈負相關(guān)。

另外，通過對HSP70濃度與不同ABI的關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)B組HSP70濃度和ABI均顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 正常組與病變組HSP70蛋白表達及其三個磷酸化位點比較

病變組HSP70蛋白表達水平及磷酸化水平明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

目前關(guān)于 LEASO 發(fā)生機制的研究表明[9]，內(nèi)皮功能障礙是發(fā)生動脈粥樣硬化的早期事件，其與動脈粥樣斑塊的進展有重要關(guān)系。近年來，“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學說”受到了廣泛關(guān)注，另一種主要學說是脂質(zhì)浸潤學說。同時研究發(fā)現(xiàn)[10]，合并冠狀動脈疾病的LEASO比率明顯高于其他疾病，高達 70%。HSP是指細胞在應(yīng)激源特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)。HSP在生物界中的一個重要特點是其在進化過程中的高度保守性。從大腸桿菌、酵母、果蠅和人體分離的分子量為70 kD的HSP，如果對其進行全氨基酸序列分析，就可發(fā)現(xiàn)其具有80%以上的相似性[11]。HSP在進化過程中的高度保守性，說明其具有普遍存在的重要生理功能，而HSP70與動脈硬化閉塞癥之間的關(guān)系十分密切。

在生理條件下，當細胞處于非應(yīng)激狀態(tài)時，HSP70的表達量較低，主要以大分子聚合物的形式存在，一般不活躍，主要作為分子伴侶調(diào)節(jié)肽的運輸、折疊和組裝[12]。當細胞受到生物或物理因素的刺激時，HSP70的表達增加，大分子聚合物解聚形成低聚物，主要受HSP70分子磷酸化的調(diào)控，HSP70有三個磷酸化位點，包括Ser15、Ser78和Ser82，其中Ser78和Ser82位于C端，Ser15位于N端。最新證據(jù)表明，磷酸化的HSP70是一種有效的抗凋亡分子[13]。在高膽固醇飲食誘導(dǎo)的大鼠主動脈粥樣硬化模型中，46種蛋白在主動脈組織中表達差異，磷酸化的HSP70水平降低[14]。磷酸化HSP70在正常動脈內(nèi)膜標本的條件培養(yǎng)基中含量豐富，而在動脈粥樣硬化條件培養(yǎng)基中卻很少發(fā)現(xiàn)。心肌活檢顯示，動脈粥樣硬化患者HSP70的磷酸化水平比正常人低20倍左右[15]。

然而，由于目前尚不清楚HSP70與LEASO不同F(xiàn)ontaine分期的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，LEASO階段越高，ABI越低，HSP70濃度越低;相反，LEASO階段越低，ABI越高，HSP70濃度越高。以往對ABI的研究結(jié)果一致認為，ABI在LEASO缺血評估中具有重要價值，準確性高[15]。HSP70濃度越高，相應(yīng)的ABI值越高;HSP70濃度越低，對應(yīng)的ABI值越低。因此，可以得出HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)的結(jié)論。此外，ABI的大小反映了LEASO的嚴重程度，即患者ABI越低，病情越嚴重，HSP70濃度越低。當HSP70濃度升高時，病情發(fā)展緩慢，反之亦然。因此，HSP70可作為評價動脈粥樣硬化的生物學指標，表明血清HSP70濃度與LEASO嚴重程度呈負相關(guān)，HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)病變組HSP70及其3個磷酸化位點的蛋白表達水平均顯著低于正常組（P<0.05）。也就是說，動脈粥樣硬化患者股動脈中HSP70的含量及其磷酸化程度明顯低于正常人股動脈。目前，關(guān)于正常人HSP70及其磷酸化含量的報道很少。本研究測定了血樣中HSP70的濃度和蛋白表達，并分析了HSP70濃度與ABI或Fontaine分期的相關(guān)性。本研究結(jié)果也為進一步研究HSP70在LEASO患者中的作用提供了很好的幫助。

綜上所述，血清HSP70濃度與LEASO嚴重程度呈負相關(guān)，而HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)。HSP蛋白的大量表達可能與人股動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。這將為今后研究LEASO的診斷、發(fā)病機制和治療奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-08-17）