（浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院 浙江杭州 311300）

《杭州市生活垃圾管理?xiàng)l例》 將生活垃圾劃分為可回收物、易腐垃圾、有害垃圾和其他垃圾4 類，其中易腐垃圾的有機(jī)質(zhì)含量很高，資源化潛力很大。廚余垃圾作為易腐垃圾的重要組成部分［1］，并不適用于目前常用的焚燒、填埋等處理方法，這些常規(guī)的處理方法不僅浪費(fèi)了資源，而且容易對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞，因此應(yīng)該從源頭減少廚余垃圾排放。使用家用廚余垃圾處理機(jī)——利用微生物將廚余垃圾降解成有機(jī)肥料，成為了目前處理廚余垃圾最簡(jiǎn)單、方便、高效、徹底的方法，同時(shí)處理后的有機(jī)肥料可以作為植物的養(yǎng)料，實(shí)現(xiàn)了資源化的目的，研究前景十分廣闊［2-3］。本實(shí)驗(yàn)通過篩選廚余垃圾高效降解菌種并研究其降解特性，目的是篩選出高效降解菌株。同時(shí)，研究菌株的耐鹽性，對(duì)菌株降解餐廚垃圾具有指導(dǎo)意義，可以省去除鹽的前處理步驟。

1 材料與方法

1.1 材料：培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；瓊脂粉20 g；蒸餾水1 000 mL；pH7.2～7.4。

淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L；可溶性淀粉2 g/L；牛肉膏5 g/L；NaCl 5 g/L；瓊脂20 g/L；pH 7.0～7.2［4］。

脂肪培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL；蛋白胨10 g；牛肉浸膏5g；NaCl 5 g；香油或花生油10 g；中性紅（體積分?jǐn)?shù)為1.6%的水溶液）15 mL～20 mL；瓊脂20 g；pH7.2［5］。

蛋白質(zhì)培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL；脫脂奶粉50 g；可溶性淀粉10 g；酵母膏5 g；KH2PO41 g；Mg SO4·7H2O 0.2 g；瓊脂20 g；pH 7.0～7.2［4］。

纖維素培養(yǎng)基：MgSO40.25 g/L；K2HPO40.50 g/L；CMC-Na 1.88 g/L；剛果紅0.20 g/L；瓊脂16.00 g/L；明膠2.00 g/L；pH 7.0［6］。

上述培養(yǎng)基分別裝入錐形瓶并放入高溫滅菌鍋120 ℃條件下滅菌20 min，倒平板備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

取1 g 市售腐熟劑溶于10 mL 蒸餾水中，充分混合后移取1mL 溶液加入9mL 無菌水中，重復(fù)上述步驟制成10-1至10-8共計(jì)8 個(gè)濃度梯度。用紫外滅菌后的移液槍移取適量菌液到平板上，用三角涂布棒進(jìn)行涂布，每個(gè)濃度涂布2 塊，待涂布完成后，將平板倒置放于恒溫黑暗新專家和省專家確立劃定高、中、低三種不同關(guān)注度。的平板上劃線提純，劃線3 次，以確保挑取的菌株是單菌落。上述過程共篩得3 株形態(tài)差異且能產(chǎn)生水解圈的菌株，命名為TS-1、TS-2 和TS-3。

1.2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線

將3 個(gè)菌種分別劃線到平板中，置于黑暗恒溫培養(yǎng)箱中，在30 ℃條件下過夜培養(yǎng)后刮取適量菌種到無菌的5 mL 牛肉膏液體培養(yǎng)基中作為母液，30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)24 h 后移取0.5 mL 母液到裝有50 mL 牛肉膏液體培養(yǎng)基的錐形瓶后，轉(zhuǎn)移到恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)速為120 r/min。放入培養(yǎng)箱的時(shí)間記為0 時(shí)刻，每隔2h 取2mL 菌液于OD600 處測(cè)定菌液的吸光度，直到菌液吸光度保持穩(wěn)定。

1.2.3 在4 種培養(yǎng)基中的水解圈以及菌落直徑測(cè)定

將3 種菌株分別劃線到平板中并置于黑暗30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，用牙簽挑取單菌落點(diǎn)接于4 種大分子有機(jī)物培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基中點(diǎn)接3 個(gè)點(diǎn)。48 h 后對(duì)菌落以及周圍水解圈的形態(tài)特征進(jìn)行觀察，淀粉培養(yǎng)基中的水解圈需滴加革蘭氏碘液才能顯現(xiàn)。

1.2.4 菌種酶活性測(cè)定

將3 個(gè)菌種分別劃線到平板中，置于黑暗恒溫培養(yǎng)箱中，在30 ℃條件下過夜培養(yǎng)后刮取適量菌種到5 mL 牛肉膏液體培養(yǎng)基中，將其放入30 ℃、120 r/min 的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后移取0.5 mL 菌液到各種子培養(yǎng)液中，種子培養(yǎng)液在相同條件下培養(yǎng)48 h 后作為母液用于酶活性測(cè)定［7］。

（1）淀粉酶活性測(cè)定。種子培養(yǎng)液：淀粉10 g；蛋白胨5 g；蒸 餾 水1000 mL；K2HPO42 g；NaCl 1 g；CaCl20.1 g；MgSO4·7H2O 0.1 g；高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌20 min［8］。

淀粉酶活力采用DNS 法測(cè)定，操作步驟如下：母液離心處理后，吸取2 mL 上清液，加入2 mL DNS 試劑后40 ℃水浴加熱5 min，反應(yīng)完成后將液體定容至25 mL，取2 mL 液體，在OD520 處測(cè)定吸光值。將1 mL 酶液每分鐘生成1 μg 麥芽糖需要的酶量定義為1 個(gè)淀粉酶活力單位。用麥芽糖溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］，見圖1。

圖1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）脂肪酶活性測(cè)定。種子培養(yǎng)液：NaNO32 g；MgSO4·7H2O 0.3 g；NaCl 10 g；橄欖油20 g；CaCl20.3g；NH4Cl 0.3 g；蒸餾水1000 mL；高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌20 min；pH 7.0［9］。

所需試劑：2%聚乙烯醇；0.0667 mol/L 的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH7.0）；95%乙醇；0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)配）；橄欖油；10 g/L 酚酞指示劑。

底物溶液的配制：將50 mL 橄欖油加入到150 mL 2%聚乙烯醇溶液中，置于離心機(jī)中預(yù)處理3 min 作為底物溶液。

取100 mL 錐形瓶3 個(gè)，標(biāo)記為A、B、C。A 作為空白組，B、C 作為實(shí)驗(yàn)樣品組，取4 mL 底物溶液和5 mL 磷酸緩沖液分別加入3 個(gè)錐形瓶中，往空白組中加入15 mL 95%乙醇后水浴預(yù)熱5 min。3 個(gè)錐形瓶中分別加入1 mL 待測(cè)酶液（空白組中加入的乙醇會(huì)使待測(cè)酶液中的脂肪酶立即失活），混合均勻后水浴預(yù)熱，10 min 后向B、C 瓶中各加入15 mL 95%乙醇終止反應(yīng)。每個(gè)瓶中滴加酚酞試劑3～5 滴，水解產(chǎn)生的游離脂肪酸采用0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。脂肪酶活的計(jì)算公式為：

式中：X 表示樣品的脂肪酶活，U/mL；B 為樣品組滴定所需NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mL；A 為空白組完成滴定所需的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mL；n 為實(shí)驗(yàn)中待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù)［10］。

（3）蛋白酶活性測(cè) 定。種子培養(yǎng) 液：K2HPO47.0 g/L；KH2PO42.0g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；干酪素4.0 g/L；酵母膏6.0 g/L；NaCl 0.5 g/L；甘油7.0 g/L；CaCl20.067 g/L；pH 7.0；高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌20 min［11］。

Folin-phenol 試劑法測(cè)定中性蛋白酶活力：先將待測(cè)母液進(jìn)行離心操作，取離心后的上層清液作為粗酶液，取1mL 粗酶液加入10 mL 離心管，40 ℃水浴加熱3 min～5 min 后向試管中加入2%的酪蛋白溶液1mL，水浴條件下反應(yīng)10 min 后立刻加入2 mL 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液以終止反應(yīng)，15 min 后過濾。吸取0.5 mL 濾液，同時(shí)加入福林-酚試劑0.5 mL 和0.4 mol/L 碳酸鈉2.5 mL，混勻后于40 ℃反應(yīng)20 min。采用3 次測(cè)定取均值的方法，空白對(duì)照組中依次加入2 mL 0.4 mol/L 的三氯乙酸溶液和1mL2%的酪蛋白溶液，15 min 后過濾，后續(xù)操作同上。以空白組為對(duì)照，在OD680 處測(cè)定吸光度。將1mL 酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸需要的酶量定義為1 個(gè)蛋白酶活單位。以標(biāo)準(zhǔn)100 μg/mL 酪氨酸濃度梯度作標(biāo)準(zhǔn)曲線［12］，見圖2。

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

（4）纖維素酶活性測(cè)定。3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測(cè)定樣品的纖維素酶活：將菌液離心后移取上清液1 mL 于試管中，加入1 mL CMC-Na 含量0.5%的檸檬酸緩沖液，在水浴鍋中50°C 條件下水浴加熱30 min 后立刻向試管中滴加DNS 試劑1 mL，將試管置于沸水中煮沸5 min 后，立刻用流水冷卻，定容至25 mL，在OD540 處測(cè)定吸光度。將測(cè)得數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出其含糖量。將1 mL 酶液每分鐘水解纖維素產(chǎn)生1 μg 葡萄糖所需的酶量定義為1 個(gè)纖維素酶活。用葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線［13］，見圖3。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5 菌種耐鹽性測(cè)定

準(zhǔn)備5 個(gè)錐形瓶，在錐形瓶中加入NaCl 濃度分別為0.5%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（真菌接種到馬鈴薯培養(yǎng)基中）50 mL，取0.5 mL 24 h 過夜培養(yǎng)的母液（母液培養(yǎng)方法同測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)所用方法）分別接種到5 個(gè)錐形瓶中，在30 ℃、120 r/min 的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次取2 mL 菌液于OD600 處測(cè)定菌液的吸光度，每次測(cè)量3次取平均，時(shí)間間隔為4 h［7］。

1.2.6 菌種測(cè)定

將3 種菌株劃線到平板上，30 ℃條件下過夜培養(yǎng)，第2 天將長(zhǎng)有單菌落的平板送至杭州有康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行菌種測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線

根據(jù)生長(zhǎng)曲線圖4 可以得知，3 種菌液的濃度在經(jīng)過約20 h 培養(yǎng)后均達(dá)到最高。因此菌種培養(yǎng)的最適時(shí)間取24 h 即可。

圖4 3 種菌株的生長(zhǎng)曲線

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落和水解圈直徑的影響

通過菌落直徑可以判斷菌種在各種大分子有機(jī)物中的生長(zhǎng)狀況，水解圈則表征菌株是否對(duì)相應(yīng)的大分子有機(jī)物具有降解能力。但由于各個(gè)菌株菌落大小不同，通過水解圈與菌落直徑的比值能更直觀地表示菌株對(duì)于各大分子有機(jī)物降解能力的強(qiáng)弱。從圖5 中可以看出3 種菌株在油脂和纖維素培養(yǎng)基上都出現(xiàn)水解圈，表明它們可能都是油脂和纖維素的優(yōu)勢(shì)降解菌，而其中又以TS-1 的菌圈比最大，說明TS-1 的纖維素降解能力最強(qiáng)；而3 個(gè)菌株中只有TS-3 在淀粉培養(yǎng)基中產(chǎn)生水解圈，且菌圈比超過3，說明TS-3 的淀粉降解能力可能較強(qiáng)，其余2 個(gè)菌株可能不具備淀粉降解能力。

2.3 菌種產(chǎn)酶

根據(jù)酶活測(cè)定結(jié)果，見圖6，TS-2 菌株具有產(chǎn)淀粉酶、脂肪酶、蛋白質(zhì)酶和纖維素酶活性，表明該菌株對(duì)4 種大分子有機(jī)物均有一定降解能力，且蛋白質(zhì)酶活高達(dá)345.7 IU，表明其可以作為1 種高效蛋白質(zhì)降解菌劑的候選菌株。TS-1 測(cè)得產(chǎn)蛋白酶225.1 IU 和產(chǎn)纖維素酶30.04 IU；TS-3 不具備產(chǎn)蛋白酶的能力，其產(chǎn)纖維素酶能力也較低，但是淀粉酶活高達(dá)437.6 IU 表明該菌株可以作為1 種高效淀粉降解的候選菌株。

圖5 菌落生長(zhǎng)情況

圖6 4 種酶活力

2.4 耐鹽性分析

由于飲食差異，各地區(qū)廚余垃圾的含鹽量有很大不同，而過高的含鹽量會(huì)影響微生物的生命活動(dòng)和降解活性，因此研究菌株的耐鹽性對(duì)微生物降解廚余垃圾具有一定的指導(dǎo)作用，對(duì)于高耐鹽性的菌株可以免去除鹽的預(yù)處理步驟。根據(jù)3個(gè)菌種在不同含鹽量的培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況，見圖7，其中TS-2 在鹽濃度為10%的培養(yǎng)液中呈現(xiàn)出絮狀沉淀影響波長(zhǎng)測(cè)定，因此舍棄，分析如下：TS-1 在濃度7.5%以下的生長(zhǎng)條件都較好，且在10%的高濃度下經(jīng)過72 h 也能夠生長(zhǎng)，因此可以判斷TS-1 的耐鹽性良好；TS-2 在鹽濃度為7.5%及以下的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀況幾乎相同，表明在濃度7.5%以下，含鹽量對(duì)其生長(zhǎng)的影響較小。且在10%的高濃度下依然可以生長(zhǎng)到正常濃度范圍，說明TS-2 的耐鹽性強(qiáng)；TS-3 在高低鹽濃度下的生長(zhǎng)情況差異較大，在含鹽量達(dá)到5%以上時(shí)生長(zhǎng)緩慢，即使開始生長(zhǎng)，濃度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到正常水平，耐鹽性較差。

2.5 菌種測(cè)定

經(jīng)鑒定，TS-1、TS-2 和TS-3 均屬于枯草芽孢桿菌。TS-1的菌落較大，呈現(xiàn)乳白色，形狀為規(guī)則的圓形，表面光滑平整，容易被挑取；TS-2 的菌落較大，呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀且邊緣有不規(guī)則的鋸齒狀，顏色為不透明的白色，表面有細(xì)微的隆起，且菌落很干燥，容易被挑??；TS-3 的菌落較小，圓形但周圍呈鋸齒狀，顏色為較透明的白色，菌落由四周向中間隆起，但隆起幅度不大，質(zhì)地粘稠，難以挑取。

圖7 3 種菌株耐鹽性情況

圖8 3 種菌株的菌落形態(tài)

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)從市售腐熟劑中篩選出了3 種菌株，將它們命名為TS-1、TS-2 和TS-3，通過16SrDNA 測(cè)得的序列號(hào)和菌種庫中的序列比對(duì)，得出3 種菌都屬于枯草芽孢桿菌。同時(shí)，通過酶活測(cè)定，每個(gè)菌都表現(xiàn)出了2 種以上的酶活性，都能夠有效降解廚余垃圾。其中TS-2 的脂肪、蛋白質(zhì)和纖維素的酶活都很高，說明它是1 株廚余垃圾高效降解菌種。

通過耐鹽性測(cè)試得出TS-1、TS-2 的耐鹽性良好，可以適用于大部分的廚余垃圾降解，在實(shí)際應(yīng)用中可以省去除鹽的預(yù)處理步驟，降低運(yùn)行成本。