河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心

王婷婷 王 芮 楊偉麗 劉艷蕊 柴天川 王 茜(石家莊 050091)

提要 目的：研究酸棗仁、延胡索、百合、地黃、半夏、夏枯草6味安神中藥對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠的睡眠只數(shù)，閾上劑量小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間以及對(duì)對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)失眠小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，探討其鎮(zhèn)靜催眠的作用及機(jī)制。方法：168只昆明小鼠，隨機(jī)分為7組：正常組、酸棗仁組(2.25 g/kg)、延胡索組(1.50 g/kg)、百合組(2.25 g/kg)、地黃組(2.25 g/kg)、半夏組(1.35 g/kg)、夏枯草組(2.25 g/kg)。連續(xù)灌胃給藥10 d，通過(guò)閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)，觀察各組小鼠睡眠只數(shù)；通過(guò)閾上劑量戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)，觀察各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間。96只昆明小鼠，隨機(jī)分為8組：正常組、模型組、酸棗仁組、延胡索組、百合組、地黃組、半夏組、夏枯草組。采用腹腔注射PCPA法復(fù)制失眠小鼠模型，藥物治療14 d。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)的含量，同法檢測(cè)垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素(CRH)的含量。結(jié)果：與正常組比較，各給藥組小鼠睡眠只數(shù)增加，睡眠潛伏期縮短，睡眠持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。與正常組比較，模型組小鼠血清NE、DA、ACTH和CRH含量升高，5-HT含量降低。與模型組比較，半夏組小鼠血清NE含量升高，延胡索組5-HT含量升高，其余各給藥組小鼠血清NE、DA、ACTH和CRH含量降低，5-HT含量降低。結(jié)論：酸棗仁、延胡索、百合、地黃、半夏、夏枯草6味安神中藥具有改善小鼠睡眠的作用，酸棗仁、延胡索、百合、地黃適用于睡后易醒的患者，半夏、夏枯草可以廣泛用于失眠患者。其作用機(jī)制可能與降低腦內(nèi)DA、NE、ACTH、CRH水平有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量(18～22)g，共168只。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫恒濕、明暗各12 h的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由進(jìn)食攝水。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)倫理審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 炒酸棗仁15 g，醋延胡索10 g，百合15 g，生地黃15 g，清半夏9 g，夏枯草15 g，選用廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒劑，生產(chǎn)批號(hào)分別為：9070783；9061383；9071273；8120113；9051013；9040013，將藥物加入100℃蒸餾水中，加熱攪拌使其充分溶解，濃縮至所需濃度：炒酸棗仁(0.225 g/mL)、醋延胡索(0.15 g/mL)、百合(0.225 g/mL)、生地黃(0.225 g/mL)、清半夏(0.135 g/mL)、夏枯草(0.225 g/mL)。將配置好的藥液置于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。戊巴比妥鈉(德國(guó)進(jìn)口分裝，批號(hào)：020402)。對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1001542324，將其充分研磨，用弱堿性生理鹽水助溶，臨用時(shí)配成40 mg/mL的混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 去甲腎上腺素(NE)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號(hào)RE59261)、多巴胺(DA) ELISA試劑盒(批號(hào)RE59161)、五-羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒(批號(hào)RE59121)均購(gòu)于德國(guó)IBL International GmbH公司； 垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA試劑盒(批號(hào)EKE-001-21)、下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素(CRH) ELISA試劑盒(批號(hào)EKE-019-06)，均購(gòu)于PhoenixBiotech公司。1-15K高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；MK3FC酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thomer Fisher公司)。

1.4 6味安神中藥對(duì)戊巴比妥鈉閾上、閾下劑量鎮(zhèn)靜催眠作用的影響

1.4.1 分組與給藥:168只雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為7組：正常組、酸棗仁組、延胡索組、百合組、地黃組、半夏組、夏枯草組，每組24只。各組小鼠的給藥劑量參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定的成人一日最大用量，根據(jù)人和動(dòng)物體表系數(shù)折算為：炒酸棗仁：2.25 g/kg、醋延胡索：1.50 g/kg、百合：2.25 g/kg、生地黃：2.25 g/kg、清半夏：1.35 g/kg、夏枯草：2.25 g/kg。正常組給予等劑量的生理鹽水灌胃，各給藥組分別給予相應(yīng)的治療藥物灌胃，每次用藥體積為0.01 mL/g，1次/d，連續(xù)10 d。

1.4.2 觀察指標(biāo):第10 d灌胃給藥50 min后，每組隨機(jī)選擇12只小鼠腹腔注射3.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液0.1 mL/10 g，觀察注射后30 min內(nèi)每組小鼠入睡只數(shù)并計(jì)算睡眠發(fā)生率。選擇剩余12只小鼠腹腔注射4.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液0.1 mL/10 g，觀察并記錄注射后30 min內(nèi)每組小鼠的睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間。從開(kāi)始注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失時(shí)間為入睡潛伏期，從翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)時(shí)間為睡眠時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中以動(dòng)物翻正反射消失達(dá) 1 min 為入睡指標(biāo)，以 30 s內(nèi)翻轉(zhuǎn)達(dá)3次為睡眠結(jié)束指標(biāo)。

1.5 6味安神藥對(duì)PCPA失眠小鼠的影響

1.5.1 動(dòng)物分組及模型建立:將96只雄性昆明小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為8組：正常組、模型組、酸棗仁組(2.25 g/kg)、延胡索組(1.50 g/kg)、百合組(2.25 g/kg)、地黃組(2.25 g/kg)、半夏組(1.35 g/kg)、夏枯草組(2.25 g/kg)，每組12只。參閱文獻(xiàn)[10]，采用腹腔注射PCPA法復(fù)制失眠小鼠模型，模型組和給藥組小鼠按40 mg/100 g腹腔注射PCPA，1次/d，連續(xù)2 d；正常組腹腔注射等劑量的生理鹽水。以小鼠晝夜節(jié)律消失，不再表現(xiàn)為晝伏夜精，而是日間與夜間皆活動(dòng)不斷為模型建立成功的標(biāo)志。

1.5.2 標(biāo)本采集 末次給藥后，各組小鼠摘眼球取血，離心15 min(4 000 r/min)，分離血清，待檢測(cè)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)。隨后立即取腦組織，于冰臺(tái)上分離下丘腦、垂體，置于凍存管中液氮凍存，-80 ℃冰箱保存，待檢測(cè)腦組織勻漿神經(jīng)遞質(zhì)含量。

1.5.3 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè) 用ELISA方法檢測(cè)血清NE、DA、5-HT和垂體ACTH和下丘腦CRH的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 IBM SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足正態(tài)性，采用單因素方差分析；不滿(mǎn)足正態(tài)性，采用Kruskal-Wails H秩和檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05 表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 睡眠只數(shù)、睡眠潛伏期、睡眠持續(xù)時(shí)間 與正常組比較，各給藥組小鼠睡眠只數(shù)增加，睡眠發(fā)生率提高，睡眠持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，除百合組外，其余給藥組睡眠潛伏期顯著縮短(P<0.01)，百合組雖然差異無(wú)顯著性(P﹥0.05)，但從數(shù)值上可以看出也可以縮短睡眠潛伏期。6味安神藥中，睡眠發(fā)生率最高的是地黃組，半夏組睡眠潛伏期最短、睡眠持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。詳見(jiàn)表1、表2。

表1 6味安神中藥閾下劑量戊巴比妥鈉 睡眠協(xié)同實(shí)驗(yàn)小鼠睡眠只數(shù)

表2 6味安神中藥閾上劑量戊巴比妥鈉睡眠協(xié)同實(shí)驗(yàn)小鼠睡眠潛伏期、睡眠持續(xù)時(shí)間

2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠血液中NE、DA、5-HT的含量變化 與正常組比較，模型組小鼠NE、DA含量顯著升高(P<0.01)，5-HT含量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，除半夏組外，其余各給藥組NE含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)；所有給藥組DA含量降低(P<0.01)；延胡索組5-HT含量升高，其余各給藥組5-HT含量降低(P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血液中NE、DA、5-HT的含量變化

2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織中ACTH、CRH的含量變化 與正常組比較，模型組小鼠ACTH、CRH含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組小鼠ACTH含量顯著降低(P<0.01)；各給藥組小鼠CRH含量顯著降低(P<0.01)，但地黃組降低幅度明顯小于其他給藥組。詳見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠腦組織ACTH、CRH的含量變化

3 討論

戊巴比妥鈉閾上劑量、閾下劑量協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物催眠功效的經(jīng)典方法[11]。本研究通過(guò)采取此種方法，觀察并記錄小鼠的睡眠發(fā)生率、睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間，從而明確6味具有安神作用的中藥的鎮(zhèn)靜催眠作用。

睡眠是一種調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)程，其發(fā)生與中樞神經(jīng)遞質(zhì)如 NE、DA、5-HT等的水平有關(guān)[12]。NE、DA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，NE是一種參與覺(jué)醒的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，其釋放量增加會(huì)引起交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致覺(jué)醒增加[13]。DA降低可減少覺(jué)醒次數(shù)，有助于促進(jìn)睡眠[14]。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與睡眠—覺(jué)醒過(guò)程，延長(zhǎng)非快速眼動(dòng)睡眠, 從而抑制覺(jué)醒, 增加深度睡眠并縮短入眠期和淺睡期，被稱(chēng)為腦內(nèi)的“致眠因子”，對(duì)睡眠的發(fā)生和維持起著重要作用[15-16]， NE與5-HT在睡眠調(diào)節(jié)過(guò)程中呈一定的消長(zhǎng)關(guān)系，5-HT水平升高時(shí)，NE釋放量則相對(duì)減少，繼而產(chǎn)生正常睡眠[17]。

下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能亢進(jìn)，負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力下降，是導(dǎo)致失眠的一個(gè)重要原因[18]。下丘腦釋放CRH, CRH作用于垂體后使其釋放ACTH，大劑量外源性的CRH補(bǔ)給可使健康人群夜間清醒度提高,睡眠效率降低[19]。

酸棗仁歸心、肝二經(jīng)，《名醫(yī)別錄》中記載：“治煩心不得眠，虛汗，煩渴，補(bǔ)中益肝氣?！笨梢责B(yǎng)心安神?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，酸棗仁總皂苷和JuA、JuB等單體成分是其鎮(zhèn)靜安神，改善睡眠的主要成分[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酸棗仁組DA、NE、5-HT含量較模型組相比，低于模型組，PCPA為5-HT合成抑制劑，足量給予時(shí)可維持失眠狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)2周之久[10]，而5-HT 可以縮短入眠期和淺睡期，所以酸棗仁對(duì)于5-HT水平降低的失眠療效不好；NE、DA降低可以減少覺(jué)醒次數(shù)，提高睡眠質(zhì)量，因此酸棗仁用于鎮(zhèn)靜安神更適用于睡后易醒的失眠患者而不適用于不易入睡的患者。

延胡索歸肝、脾二經(jīng)，具有活血、行氣、止痛的功效，能行血中氣滯，氣中血滯。有研究表明延胡索主要藥效成分生物堿，具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛等藥理作用[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，延胡索可以顯著降低DA、NE水平，減少覺(jué)醒次數(shù)；顯著升高5-HT水平，延長(zhǎng)非快速眼動(dòng)睡眠, 從而抑制覺(jué)醒。延胡索能降低ACTH和CRH水平，但相比其他組而言，降低效果不顯著，故延胡索在降低夜間清醒度的方面作用不顯著。因此，延胡索用于鎮(zhèn)靜安神更適用于睡后易醒的失眠患者，而不適用于早醒的患者。

百合入心、肺經(jīng)，性微寒，有清心除煩、寧心安神之功[22]，其作用機(jī)制可能與增加單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸亢進(jìn)有關(guān)[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，百合組調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的水平均較好，尤其在降低NE水平方面效果最好，因此百合可以廣泛用于各種失眠患者，尤其是睡后易醒的患者。

實(shí)驗(yàn)選用生地黃，性寒，味甘、苦，有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地黃組調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的水平均較好，因此地黃可以廣泛用于各種失眠患者。基于《金匱要略》中的百合地黃湯，臨床中百合地黃常配伍使用，養(yǎng)心肺之陰, 清心肺虛火。因此，百合、地黃用于鎮(zhèn)靜安神更適用于陰虛火旺，睡后易醒的失眠患者。

半夏性溫，味辛，能燥濕化痰，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中記載:“半夏：味辛，性溫，有毒。凡味辛之至者，皆稟秋金收降之性，故力能下達(dá)為降胃安沖之主藥。為其能降胃安沖，所以能止嘔吐，能引肺中、胃中濕痰下行，納氣定喘。能治胃氣厥逆、吐血、衄血?！盵24]夏枯草性寒、味辛、苦，有清火明目、散結(jié)消腫之功?！独鋸]醫(yī)話》曰：“蓋半夏得陰而生，夏枯草得陽(yáng)而長(zhǎng)，是陰陽(yáng)配合之妙也?！笔哒且环N陽(yáng)不入陰之陰陽(yáng)失調(diào)的疾病[25]。有研究表明，半夏與夏枯草配伍對(duì)治療失眠療效良好[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，半夏組和夏枯草組在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平方面相對(duì)于其他組效果最顯著，因此二者無(wú)論單味藥使用還是配伍使用都可以廣泛用于失眠患者，無(wú)論是早醒、睡后易醒還是不易入睡的患者皆可使用。

綜上所述，酸棗仁、延胡索、百合、地黃、半夏、夏枯草6味安神中藥均對(duì)改善小鼠睡眠作用有一定效果，均可縮短睡眠潛伏期、延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間。對(duì)治療失眠有一定的療效，酸棗仁、延胡索、百合、地黃適用于睡后易醒的患者，半夏、夏枯草可以廣泛用于失眠患者。其作用機(jī)制可能與降低腦內(nèi)DA、NE、ACTH、CRH水平有關(guān)。