黃勝 龔蕊 劉贛贛 漆啟華 黃帥

1南昌大學第一附屬醫(yī)院骨科（南昌330006）；2江西衛(wèi)生職業(yè)學院臨床醫(yī)學系（南昌330052）；3廣州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科（廣州510260）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是發(fā)達國家中男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)男性發(fā)病率最高的腫瘤［1］。我國前列腺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。骨組織是前列腺癌最易發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位，大約有84%晚期前列腺癌患者最終發(fā)生骨轉(zhuǎn)移［2］。目前，針對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療多為姑息性治療，主要包括以內(nèi)分泌治療和化療為主的全身治療，以及針對骨轉(zhuǎn)移的局部治療，如手術、放療、雙膦酸鹽和骨靶向治療等。盡管早期篩查，診斷技術提高和放化療降低了前列腺癌患者的死亡率，但治療癌癥的藥物所產(chǎn)生的副作用嚴重影響了患者的生存質(zhì)量。因此，尋找療效好、毒副作用小的理想藥物，對晚期前列腺癌的治療具有非常重要的意義，也是目前醫(yī)藥學研究的熱點。

五味子甲素（deoxyschizandrin）是從五味子中提取的一種木脂素類化合物，是中藥五味子的有效成分之一［3］。五味子甲素具有護肝、抗炎、抗凝血、防護腎損傷、抗抑郁及抑制胃腸平滑肌收縮等作用［4-6］。最新研究表明，五味子甲素在多種腫瘤治療方面有潛在的應用價值，如甲狀腺癌［7］、腸癌［8］及乳腺癌［9］等。然而，五味子甲素對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制仍不清楚。

miRNAs 是一類內(nèi)源性非編碼微小RNA（長約18-22nt），通過與靶基因3′-UTR 的miRNA 識別元件結合，轉(zhuǎn)錄后抑制或降解mRNA，從而在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用［10-12］。研究報道，五味子甲素的抗癌作用與miRNAs 的調(diào)控密切相關，如miR-155［9］、miR-195［8］和miR-429［7］等。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p 通過直接靶向SMAD2 和SMAD3，抑制TGF-β信號通路的活性，從而抑制前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力［13］。因此，筆者推測五味子甲素是否通過調(diào)控miR-505-3p 來影響前列腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲。因此，本研究旨在研究五味子甲素對PC-3 細胞體外增殖、遷移及侵襲的影響，并進一步探討其是否通過影響miR-505-3p 表達來調(diào)控TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路，從而抑制前列腺癌體外轉(zhuǎn)移，為五味子甲素在前列腺癌的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑人前列腺癌PC-3 細胞系購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；五味子甲素購自武漢慧誠益通生物公司；6 周齡雄性BALB/c裸鼠購自中山大學實驗動物中心；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國HyClone 公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Tranwell 小室購自美國Millipore 公司；Matrigel 膠購自美國BD 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒購自廣州復能基因有限公司；Lipofectamine 2000 和miR-505-3p inhibitor 購于廣州銳博生物科技有限公司；SMAD2、SMAD3、pSMAD2/3、SMAD2/3 和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；p84抗體購自美國Invitrogen。

1.2 CCK-8 檢測細胞增殖將PC-3 細胞以每孔100 μL（2 × 104個/孔）接種于96 孔培養(yǎng)板，細胞貼壁后加入濃度為0、5、10、20、40、80 μmol/L 的五味子甲素，每組設5 個復孔，孵育24 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，酶標儀檢測波長在450 nm 處的吸光度值。用15 μmol/L 的五味子甲素處理PC-3細胞，分別培養(yǎng)0、1、2、3、5 d，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，多功能酶標儀檢測各孔的吸光度值（450 nm）。

1.3 qRT-PCRTRIzol 試劑提取樣品的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成miRNA 和mRNA 的cDNA。隨后，使用RT-PCR 試劑盒在Bio-Rad CFX96TM上進行PCR 擴增。以U6 或GAPDH 為參照，用2-ΔΔCq法分析miRNA 和mRNA 的相對表達水平。所用引物序列如下：U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-505-3p 上游引物：5′-CTACGTGGGTCACCCCCTC-3′，下游引物：5′-CCAAAGGAGACCTCGTAGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；IL-11 上游引物：5′-TGAAGACTCGGCTGTGACC-3′，下游引物：5′-CCTCACGGAAGGACTGTCTC-3′；PTHRP 上游引物：5′- ACTCGCTCTGCCTGGTTAGA-3′，下游引物：5′-GGAGGTGTCAGACAGGTGGT-3′；CTGF 上游引物：5′-GCTACCACATTTCCTACCTAGAAATCA-3′，下游引物：5′-GACAGTCCGTCAAAACAGATTGTT-3′。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染將PC-3 細胞接種于6 孔板中（3×105/孔），置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長融合至50%～60%，準備轉(zhuǎn)染；按照制造商的說明使用Lipofectamine 2000 進行miR-505-3p inhibitor 的轉(zhuǎn)染。

1.5 Transwell 檢測細胞遷移及侵襲不同濃度的五味子甲素處理PC-3 細胞24 h 后，胰蛋白酶消化后重懸，將200 μL 細胞懸液（1×106個/mL）接種于Transwell 小室的上室，并將含10%FBS 的培養(yǎng)基加入下室，然后置入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色。濕棉簽小心擦去上室基底膜上表面的細胞，洗凈殘余的染色液，晾干，顯微鏡下隨機取五個視野中進行拍照及計數(shù)。不使用Matrigel 基質(zhì)膠覆蓋Transwell 細胞小室時檢測細胞遷移，而在使用Matrigel 基質(zhì)膠覆蓋Transwell 細胞小室的情況下檢測細胞侵襲。

1.6 Western blot 檢測將PC-3 細胞均勻接種于6 孔培養(yǎng)板中，24 h 細胞貼壁后，加入不同藥物濃度的五味子甲素處理48 h。RIPA 裂解液提取處理后細胞蛋白，并用BCA 法進行蛋白定量。通過10% SDS-PAGE 分離等量的蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，然后在TBST 洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h。最后，ECL 法顯色曝光。

1.7 裸鼠成瘤模型及處理將0.2 mLPC-3 細胞（1 ×106個）接種于裸鼠背部皮下。待裸鼠腫瘤形成后，挑選瘤體積相近的裸鼠隨機分組，分為對照組和五味子甲素治療組，每組各6 只。其中對照組不給予任何藥物，每天給予正常飲食；五味子甲素治療組，予五味子甲素（500 mg/kg）灌胃給藥，1 次/2 d，給藥3 周后處死小鼠，剝離出瘤體組織，稱重后進行后續(xù)實驗。

1.8 免疫組化實驗將腫瘤組織切片后進行脫蠟處理，酒精梯度水化、抗原修復、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷和山羊血清室溫封閉后，加入一抗。滴加標記有HRP 的二抗，室溫孵育30 min，顯色劑顯色。蘇木精行細胞核復染，乙醇水化及二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下進行閱片和結果判定，并對免疫組化結果進行光密度分析。

1.9 統(tǒng)計學方法SPSS 19.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）用于統(tǒng)計學分析，所有的實驗均重復3 次以上，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 五味子甲素對PC-3 細胞增殖的影響不同濃度的五味子甲素處理PC-3 細胞48 h 后，采用CCK-8 檢測細胞增殖情況。隨著五味子甲素濃度的升高，PC-3 細胞增殖受到抑制的程度越來越顯著（P＜0.01），且呈劑量依賴性（圖1A）。細胞增殖抑制率的IC50為15.74 μmol/L。將濃度為15 μmol/L的五味子甲素處理PC-3 細胞，檢測不同時間點（1、2、3、4、5 d）PC-3 細胞的增殖情況。結果表明，與DMSO 對照組比較，五味子甲素處理2、3、4、5 d對PC-3 細胞的增殖抑制作用差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1B）。

圖1 五味子甲素對PC-3 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of deoxyschizandrin on proliferation of PC-3 cells

2.2 五味子甲素對PC-3 細胞遷移及侵襲能力的影響Transwell 遷移及侵襲實驗結果顯示（圖2），與對照組相比，用不同濃度五味子甲素處理的PC-3 細胞48 h 后，細胞遷移及侵襲能力明顯受抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且這種抑制作用呈劑量依賴性。

2.3 五味子甲素對PC-3細胞miR-505-3p 和TGFβ信號通路的影響qRT-PCR 結果表明，與對照組相比，不同濃度的五味子甲素（5、10、15 μmol/L）處理PCa骨轉(zhuǎn)移PC-3細胞48 h后，miR-505-3p的表達上調(diào)（P＜0.01），而SMAD2、SMAD3以及TGF-β信號傳導的下游靶基因（包括IL-11，PTHRP 和CTGF）的mRNA 表達均降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性（圖3）。Western blot 結果顯示，與對照組相比，五味子甲素（15 μmol/L）處理的PC-3 細胞細胞核中SMAD2/3 蛋白表達無顯著差異，而細胞核中pSMAD2/3 蛋白表達顯著降低（P＜0.01，圖4）。

2.4 下調(diào)miR-505-3p 逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用為了進一步探討miR-505-3p是否參與五味子甲素對PC-3細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用，五味子甲素（15 μmol/L）處理miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染的PC-3 細胞48 h，分別采用CCK-8 檢測細胞增殖、Transwell 檢測細胞遷移及侵襲情況。CCK-8 細胞增殖實驗結果顯示（圖5A），與對照組相比，miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后PC-3 細胞增殖能力增強，且miR-505-3p inhibitor能夠逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細胞增殖的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Transwell 遷移及侵襲實驗結果顯示（圖5B、C），與對照組相比，miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后PC-3 細胞遷移及侵襲能力增強，且miR-505-3p inhibitor 能夠逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細胞遷移和侵襲的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。因此，抑制miR-505-3p 表達后，五味子甲素對PC-3 細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用明顯減弱。

圖2 五味子甲素對PC-3 細胞遷移及侵襲能力的影響Fig.2 Effect of deoxyschizandrin on migration and invasion of PC-3 cells

圖3 五味子甲素對miR-505-3p 和TGF-β信號通路相關基因表達的影響Fig.3 Effect of deoxyschizandrin on the expression of miR-505-3p and TGF-β signaling pathway-related genes

圖4 五味子甲素對TGF-β信號通路相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Deoxyschizandrin on the expression of TGF-β signaling pathway-related proteins

2.5 五味子甲素對荷瘤裸鼠的腫瘤抑制作用及miR-505-3p、SMAD2、SMAD3 表達的影響對荷瘤裸鼠的治療實驗結果顯示，對照組的腫瘤重量為（137.7±16.17）mg，而五味子甲素（500 mg/kg）組體積為（23.67 ± 23.67）mg，兩組腫瘤重量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖6B）。qRT-PCR 檢測結果表明，miR-505-3p在五味子甲素組表達水平顯著高于對照組組（P＜0.01，圖6C）。免疫組織化學結果顯示（圖6A、D、E），SMAD2 和SMAD3 蛋白在五味子甲素組表達水平顯著低于對照組（P＜0.01）。

圖5 下調(diào)miR-505-3p 對五味子甲素作用下PC-3 細胞增殖、遷移及侵襲的影響Fig.5 Effect of knockdown of miR-505-3p on proliferation，migration and invasion of PC-3 cells treated with deoxyschizandrin

圖6 五味子甲素對裸鼠移植瘤的生長抑制及miR-505-3p、SMAD2、SMAD3 表達的影響Fig.6 Effect of deoxyschizandrin on tumor growth and miR-505-3p、SMAD2、SMAD3 expression in nude mouse xenograft model

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是晚期前列腺癌患者的主要并發(fā)癥，84%患者最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移，而骨轉(zhuǎn)移又是前列腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位［2］。目前，針對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療多為姑息性治療，總體治療效果并不盡如人意。因此，亟待尋找療效好、毒副作用小的藥物，來緩解晚期前列腺癌患者的痛苦。研究報道，多種中藥成分具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，已被證明是非常有前景的癌癥治療藥物。目前，多種中藥及其有效成分展示了良好的抗前列腺癌活性，如松杉靈芝提取物抑制轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞系中的PI3K/Akt 和MAPK/ERK 信號通路，誘導細胞周期停滯并激活半胱天冬酶細胞凋亡途徑［14］；荔枝種子提取物以劑量依賴方式抑制前列腺癌細胞系的細胞活力和克隆生長，通過失活蛋白激酶B 信號通路，誘導細胞凋亡和細胞周期G1/S 期停滯，同時通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表型抑制細胞遷移和侵襲［15］；黃芩提取物抑制前列腺癌細胞系增殖，顯著抑制裸鼠移植瘤生長［16］。五味子甲素是從五味子中提取物的一種木脂素類化合物，具有護肝、抗炎、抗凝血、防護腎損傷、抗抑郁、抑制胃腸平滑肌收縮及抗腫瘤等作用［4］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)五味子甲素在多種癌癥中具有潛在抗癌作用［7-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子甲素作用前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3 細胞的IC50為15.74 μmol/L，五味子甲素以劑量和時間依賴方式抑制PC-3 細胞增殖，同時以劑量依賴方式抑制細胞遷移及侵襲，這些提示五味子甲素具有良好的抗前列腺癌活性，具有開發(fā)成新型抗腫瘤藥物的潛在價值。

miRNAs 被證實在人類很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，如直腸癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等［10］。研究報道，五味子葉素的抗癌作用與miRNAs 的調(diào)控密切相關。五味子甲素通過下調(diào)miR-155 的表達，導致PI3K/AKT 和Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制乳腺癌細胞系增殖和遷移［9］。五味子甲素通過上調(diào)miR-195 的表達，抑制PI3K/AKT 和NF-κB 信號通路，從而增強結腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性［8］。此外，五味子甲素通過下調(diào)miR-429 使Wnt/β-catenin 和MEK/ERK信號通路失活，從而抑制甲狀腺癌細胞系的增殖、遷移及侵襲［7］。miR-505-3p已經(jīng)被證實與多種疾病密切相關，包括原發(fā)性膽汁性肝硬化，帕金森氏病、炎癥性腸病、胰腺癌、膠質(zhì)瘤和乳腺癌等［17-19］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p 在伴骨轉(zhuǎn)移的PCa組織中低表達，過表達miR-505-3p 能夠抑制PCa細胞的侵襲和遷移能力［13］。但五味子甲素是否能通過上調(diào)miR-505-3p 的表達，從而抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，目前未見文獻報道。本研究用不同濃度的五味子甲素處理前列腺癌PC-3 細胞48 h 后，發(fā)現(xiàn)五味子甲素以劑量依賴方式上調(diào)PC-3細胞中miR-505-3p的表達。此外，本研究用五味子甲素（15 μmol/L）處理miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染的PC-3 細胞，CCK-8 及Transwell 實驗結果顯示，與對照組相比，miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后PC-3 細胞增殖、遷移及侵襲能力均增強，而miR-505-3p inhibitor 能夠逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。因此，筆者認為五味子甲素通過上調(diào)miR-505-3p的表達，從而抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細胞增殖、遷移及侵襲。

轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路參與調(diào)控細胞增殖、分化、遷移、粘附、細胞外基質(zhì)重塑、衰老和凋亡，在胚胎發(fā)育、免疫反應、傷口愈合和腫瘤進展等生物學過程中發(fā)揮著重要作用［20-21］。TGF-β信號通路在腫瘤進展中具有雙重調(diào)控作用。在腫瘤生長早期，TGF-β信號通路抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡；在腫瘤生長晚期，TGF-β信號通路通過促進血管生成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫逃逸來誘導腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［22-23］。研究表明，TGF-β通過誘導EMT 或促進癌細胞的侵襲性而成為PCa 骨轉(zhuǎn)移的關鍵因素［24-25］，靶向TGF-β的療法可有效減少腫瘤細胞的骨轉(zhuǎn)移［26］。因此，靶向TGF-β信號通路似乎是抑制PCa 骨轉(zhuǎn)移的理想靶標。本研究采用不同濃度的五味子甲素PC-3 細胞48 h 后，qRT-PCR 結果發(fā)現(xiàn)，五味子甲素以劑量依賴方式抑制PC-3 細胞中SMAD2、SMAD3 以及TGF-β信號傳導的下游靶基因（包括IL-11，PTHRP 和CTGF）的mRNA 表達。Western blot 結果進一步證實，五味子甲素處理的PC-3 細胞細胞核中SMAD2/3 蛋白表達無顯著差異，而細胞核中pSMAD2/3 蛋白表達顯著降低。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p 通過靶向SMAD2 和SMAD3 抑制TGF-β信號通路的激活，從而抑制PCa細胞的侵襲和遷移［13］。本研究通過構建裸鼠移植瘤模型證實，五味子甲素顯著抑制PC-3 細胞裸鼠移植瘤生長；五味子甲素上調(diào)腫瘤組織中miR-505-3p 的表達水平，同時抑制腫瘤組織SMAD2 和SMAD3 蛋白的表達。因此，五味子甲素可能通過上調(diào)移植瘤組織中miR-505-3p 的表達，抑制TGFβ信號通路，從而抑制移植瘤的生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)五味子甲素可能是通過上調(diào)miR-505-3p 的表達，靶向下調(diào)SMAD2 和SMAD3 來抑制TGF-β通路激活，從而抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3 細胞的增殖、遷移和侵襲。