李海濤 林勁 韓麗珍 王裕岱 滕麗峰

海南省人民醫(yī)院（海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院）心血管內(nèi)科（?？?70311）

位于血管壁中膜層的平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）在血管收縮、壓力、環(huán)境以及損傷過程中均具有重要的作用。由微管、微絲、中等纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即為細(xì)胞骨架［1-3］。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1，NRG-1）其胞外結(jié)構(gòu)域與表皮生長因子相似，但是其具有較為保守的NRG-1 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（neuregulin 1 intracellular domain，NRG-1-ICD）。NRG-1 在被水解后成為活性物質(zhì)釋放到細(xì)胞外，NRG-1-ICD 則會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與基因表達(dá)調(diào)控。研究證實(shí)在心血管生理及病理中NRG-1 發(fā)揮非常重要的作用［3］。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）在正常組織細(xì)胞中廣泛存在，具有多重生物效應(yīng)。VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化與TGF-β1 的基因調(diào)控有關(guān)［4］。但是，關(guān)于NRG-1-ICD 是否參與VSMC 分化以及VSMCs 的功能如何被NRG-1-ICD 影響的研究相對較少，且結(jié)論不統(tǒng)一。本次研究以TGF-β1 作為誘導(dǎo)因素為進(jìn)一步分析NRG-1-ICD 對VSMC 功能的影響機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠，周齡8 ～12 周，平均周齡（10.7 ± 1.3）周，本次研究動(dòng)物均由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，且本次實(shí)驗(yàn)已獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)提前制備好的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，待細(xì)胞生長至75%左右時(shí)更換為饑餓培養(yǎng)模式，時(shí)間為24 h，加入刺激因素的時(shí)間為細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入靜止期后，收集培養(yǎng)所獲得細(xì)胞。

1.3 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞選取80 ～100 g 健康雄性SD 大鼠，對大鼠進(jìn)行麻醉處理，術(shù)區(qū)進(jìn)行備皮，分離大鼠胸腹主動(dòng)脈，采用貼塊法進(jìn)行細(xì)胞分離，進(jìn)行VSMC 培養(yǎng)，選取濃度為10%的FBS進(jìn)行培養(yǎng)，直至細(xì)胞生長至混合后進(jìn)行細(xì)胞消化，加入濃度為0.25%的蛋白酶，實(shí)驗(yàn)選擇第3 ～5 代細(xì)胞。

1.5 主要試劑人血管內(nèi)皮細(xì)胞試劑盒購于廈門慧嘉生物科技有限公司，兔抗NRG-1 多克隆抗體、兔抗NRG-1-ICD 單克隆抗體、鼠抗α-SMA 單克隆抗體均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，鼠抗β-actin 單克隆抗體購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，F(xiàn)luorescein-Labeled 熒光二抗、Rhoda mine-Labeled 熒光二抗均購于蓋德化工，qRT-PCR 引物、總RNA 提取試劑盒購于Sigma 公司，NRG-1 腺病毒載體、NRG-1-ICD 腺病毒載體購于OMEGA 公司，TRITC-鬼筆環(huán)肽購于Invitrogen 公司，HRG-β1購于OMEGA 公司。

1.6 實(shí)驗(yàn)儀器高速離心機(jī)購于上海舜制儀器制造有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購于上海精密儀器儀表有限公司，多功能顯微鏡、精光共聚焦顯微鏡購于美國Leica 公司，超純水凈化裝置購于Milli-Qufplus 公司，紫外凝膠成像系統(tǒng)購于南京順泰科技有限公司，ECL 化學(xué)發(fā)光儀購于Bio-rad公司。

1.7 方法

1.7.1 取材處死小鼠，對其動(dòng)脈血管系統(tǒng)進(jìn)行處理后，確定血管損傷部位，然后每隔30 μm 進(jìn)行一次連續(xù)切片，張數(shù)以10 張為宜，在超出損傷部位2 mm 后停止切片。

1.7.2 Western blot 分析進(jìn)行蛋白樣品制備，對樣本蛋白濃度進(jìn)行測定，根據(jù)測定結(jié)果將其配制成固定濃度的單本樣品，進(jìn)行蛋白變性后，配膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜處理后加一抗、二抗，經(jīng)反應(yīng)后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測，采用對應(yīng)的圖像分析軟件進(jìn)行分析，經(jīng)曝光后，記錄灰度條。

1.7.3 PCR 檢測NRG-1mRNA 表達(dá)水平對細(xì)胞總RNA 進(jìn)行提取，分析RNA 濃度及純度，合成cDNA，設(shè)計(jì)PCR 引物，并合成cDNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

1.7.4 鬼筆環(huán)肽染色法將制備好的細(xì)胞接種到孔板中，選擇12 孔板，然后進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，病毒選擇為GFP-NRG-ICD、GFP-NRG、GFP，將CB 刺激因素加入，進(jìn)行2 h 培養(yǎng)后洗滌，進(jìn)行15 min 打孔，使用濃度1%的Triton X-100，加入鬼筆環(huán)肽，使用TRITC 標(biāo)記，進(jìn)行45 min 孵育，沖洗。進(jìn)行封片處理，加入提前稀釋好的DAPI，共聚焦顯微鏡下觀察染色情況，對熒光強(qiáng)度進(jìn)行記錄［5］。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7.5 免疫熒光共定位分析將制備好的細(xì)胞接種到12 孔板上，給予刺激因素TGF-β1，洗滌后進(jìn)行15 min 打孔，使用濃度1%的Triton X-100 進(jìn)行。20 min 封閉，使用山羊血清室溫封閉，將鼠抗α-SMA 抗體以及兔抗NRG-1-ICD 抗體加入，孵育，采用TRITC 標(biāo)記羊抗兔二抗，以FITC 標(biāo)記羊抗鼠二抗，滴加到樣本中后進(jìn)行1 h 孵育，封片觀察。

1.7.6 GST pull-down 實(shí)驗(yàn)完成轉(zhuǎn)化后的GST空載體第2 天將細(xì)胞加入到含氨芐抗性的LB 培養(yǎng)基中，添加IPTG 誘導(dǎo)融合蛋白。離心、沉淀細(xì)菌，收集上清，測定蛋白含量。沉淀實(shí)驗(yàn)分別轉(zhuǎn)移20 μL GST 珠子于兩1.5 mLEP 管中，離心，加2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5 min，收集GST 珠子結(jié)合物。裂解收集細(xì)胞，離心，收集兩份珠子結(jié)合物，取上清與上述樣品一起電泳觀察［6］。

1.7.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 上調(diào)NRG-1 在人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMC）中的表達(dá)經(jīng)熒光染色后顯示，NRG-1 與α-SMA 共定位。經(jīng)RT-PCR 分析顯示，在大鼠平滑肌細(xì)胞、人平滑肌細(xì)胞以及人內(nèi)皮細(xì)胞中均存在NRG-1 的mRNA 表達(dá)。經(jīng)Western blot 檢測，在不同種屬的平滑肌細(xì)胞中均存在NRG-1 蛋白的表達(dá)，具體見圖A、B、C。在對血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在人平滑肌細(xì)胞中，NRG-1 的表達(dá)隨PDGF-BB 刺激時(shí)間延長而降低。在給予TGF-β1 刺激時(shí)，NRG-1 的表達(dá)隨PDGF-BB 刺激時(shí)間延長而增加，見圖1D、E。

圖1 TGF-β1 調(diào)控NRG-1 在HASMC 中的表達(dá)結(jié)果Fig.1 TGF-β1 regulates the expression of NRG-1 in HASMC

2.2 在細(xì)胞骨架組構(gòu)中NRG-1-ICD 參與情況分析經(jīng)鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果分析，對于應(yīng)力纖維增粗、肌絲成束NRG-1過表達(dá)可以起到促進(jìn)作用。給予TGF-β1 干預(yù)，不會(huì)影響細(xì)胞骨架，但是NRG-1-ICD 過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞骨架呈現(xiàn)束狀排列。認(rèn)為過表達(dá)NRG-1可通過NRG-1的ICD結(jié)構(gòu)域來參與細(xì)胞骨架的重塑。且過表達(dá)的NRG-1 對于乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮可以起到促進(jìn)作用。具體見圖2。

圖2 NRG-1-ICD 在細(xì)胞骨架組構(gòu)中參與情況分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of NRG-1-ICD participation in cytoskeleton organization

2.3 TGF-β1 對NRG-1/NRG-1-ICD 與α-SMA 相互作用的影響經(jīng)細(xì)胞免疫熒光檢測，α-SMA、NRG-1-ICD 在未經(jīng)TGF-β1 處理人平滑肌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)情況。在加入TGF-β1 處理后，α-SMA、NRG-1-ICD 表達(dá)均呈現(xiàn)明顯升高趨勢，位置在胞漿。Western blot 分析，在基礎(chǔ)水平時(shí)NRG-1/NRG-1-ICD 均可與α-SMA 結(jié)合，在經(jīng)TGF-β1 刺激后明顯升高。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 和NRG-1/NRG-1-ICD 的相互作用可在TGF-β1 作用下變強(qiáng)，見圖3。

3 討論

血管重塑是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓以及血管再狹窄等疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，而血管內(nèi)膜增生是血管重塑的主要病變因素［7-8］。血管平滑肌在血管損傷后由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，在原有?xì)胞功能基礎(chǔ)上增加了遷移、增殖能力［9-11］。

NRG-1 具有較高的生物活性，可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，在缺血性腦組織中NRG-1 對于炎癥反應(yīng)可以起到抑制作用，對MMP-9、IL-1β、ICAM-1 等因子表達(dá)可以起到抑制作用［12-13］。NRG-1 的亞型NRG-1β可在心肌細(xì)胞里降低I 型、III 型膠原蛋白，NRG-1β可通過刺激副交感神經(jīng)方式起到心臟保護(hù)效果［12，14］。研究還發(fā)現(xiàn)NRG-1β在心血管系統(tǒng)中具有抗腎上腺素功能，對于血管舒張起到促進(jìn)作用［14-16］。有研究指出，注射NRG-1β可有效降低大鼠缺血造成的心臟功能障礙以及腦損傷程度［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育、結(jié)構(gòu)維持以及心臟功能完整性中，NRG-1 以及其受體均發(fā)揮著非常重要的作用［19］。

雖然已有研究指出給予外源性NRG-1 干預(yù)，可對PDGF-BB 引起的細(xì)胞前移、增殖起到抑制作用［20］，前期研究也已證實(shí)TGF-β1 是調(diào)節(jié)平滑肌標(biāo)志基因表達(dá)的重要細(xì)胞因子，但是目前并無給予NRG-1β刺激是否可以調(diào)控人平滑肌細(xì)胞中NRG-1 表達(dá)的研究。本次研究可以發(fā)現(xiàn)，NRG-1 在小鼠以及人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，且在小鼠平滑肌細(xì)胞中表達(dá)更高。在給予TGF-β1 刺激后，PDGF-BB 可抑制NRG-1 在人血管平滑肌中的表達(dá)。對細(xì)胞骨架蛋白分析發(fā)現(xiàn)，NRG-1-ICD 與細(xì)胞骨架穩(wěn)定性存在密切聯(lián)系，且其調(diào)控作用可能與α-SMA 有關(guān)，對于細(xì)胞收縮功能起到促進(jìn)作用。推測可能與NRG-1 的C 端很有結(jié)構(gòu)域有關(guān)，而該結(jié)構(gòu)域可以α-肌動(dòng)蛋白產(chǎn)生相互作用，對骨架蛋白的形成產(chǎn)生影響。

綜上所述，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上TGF-β1 可上調(diào)NRG-1 的表達(dá)；在細(xì)胞收縮中，TGF-β1 對于α-SMA與NRG-1-ICD之間的表達(dá)可以起到促進(jìn)作用。

圖3 TGF-β1 對NRG-1/NRG-1-ICD 與α-SMA 相互作用的影響結(jié)果Fig.3 The effect of TGF-β1 on the interaction between NRG-1/NRG-1-ICD and α-SMA