華天楨 馬雨詩 房賀

海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1學(xué)員四大隊(duì)十隊(duì)，2學(xué)員三大隊(duì)七隊(duì)（上海200433）；3海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科（上海200433）

肝臟是哺乳動物中最大的具有多種合成和分泌功能的器官，承擔(dān)著物質(zhì)存儲、能量代謝、氨基酸利用、膽汁酸合成與排泄、生物氧化、生物轉(zhuǎn)化、解毒、免疫應(yīng)答等重要生理功能。肝臟由肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、免疫細(xì)胞等組成。各種致病因素包括病毒感染、毒素、藥物使用、自身免疫缺陷、遺傳疾病和繼發(fā)器官功能障礙［1］，可損害肝功能，導(dǎo)致慢性肝病或急性肝衰竭。對于嚴(yán)重肝損傷或者肝衰竭患者，采取原位肝移植治療仍是目前最有效的方法。據(jù)報(bào)道，接受原位肝移植的患者5年生存率可達(dá)70%以上。然而，由于供體缺乏、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、長期并發(fā)癥以及倫理問題，原位肝移植在臨床中的應(yīng)用受到諸多限制。作為原位肝移植的潛在替代療法，肝細(xì)胞移植方法簡單，創(chuàng)傷小且相對安全，近年來在臨床中得到越來越多的應(yīng)用。然而，肝細(xì)胞增殖擴(kuò)散能力有限、功能相對單一，臨床應(yīng)用依然存在瓶頸。干細(xì)胞具有來源廣泛、自我更新和多向分化潛能的特性，干細(xì)胞移植可以幫助嚴(yán)重肝損傷或者肝衰竭患者度過危險(xiǎn)期，等待肝移植肝源；又可以作為細(xì)胞療法直接修復(fù)肝臟損傷，應(yīng)用于臨床治療肝損傷、肝衰竭及各種終末期肝病。本文旨在介紹干細(xì)胞的基本類別，闡明干細(xì)胞治療多種肝損傷的具體機(jī)制，歸納干細(xì)胞治療肝損傷的臨床研究與應(yīng)用，分析干細(xì)胞在肝損傷治療中存在的問題。筆者擬通過綜述干細(xì)胞在肝損傷治療中的應(yīng)用與機(jī)制研究，結(jié)合干細(xì)胞在肝損傷治療領(lǐng)域的新應(yīng)用、新進(jìn)展，對臨床治療提供新的思路。

1 肝源性干細(xì)胞與非肝源性干細(xì)胞

干細(xì)胞來源廣泛，根據(jù)研究需要，目前一般將應(yīng)用于肝損傷修復(fù)的干細(xì)胞分為肝源性肝干細(xì)胞和非肝源性肝干細(xì)胞兩類。肝源性肝干細(xì)胞又稱為內(nèi)源性肝干細(xì)胞，主要包括小肝細(xì)胞樣前體細(xì)胞、肝卵圓細(xì)胞等［2］。非肝源性肝干細(xì)胞是肝外來源的所有干細(xì)胞的總稱，包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、骨髓干細(xì)胞等不同種類的干細(xì)胞。

肝卵圓細(xì)胞是一類細(xì)胞核呈卵圓形、比肝細(xì)胞體積小、核質(zhì)比較高的肝前體細(xì)胞，可向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化。進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)，不易阻塞血管引起肝門靜脈高壓。然而其干細(xì)胞特性維持時(shí)間短，且易大量增殖破壞肝實(shí)質(zhì)組織，甚至引發(fā)肝硬化［3］。

小肝細(xì)胞樣前體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與成熟肝細(xì)胞相似，但體積較小，只具有向肝細(xì)胞的分化的單一潛能。也有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過誘導(dǎo)，其同樣具備向卵圓細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化的潛能。然而小肝細(xì)胞樣前體細(xì)胞作用于肝損傷的機(jī)制尚不明了，其治療應(yīng)用仍需探索［4］。

ESCs 來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是具有自我更新和分化全能性的原始細(xì)胞，能分化為人體所有組織功能特異性細(xì)胞。ESCs 自我復(fù)制能力極強(qiáng)，體外培養(yǎng)可維持未分化狀態(tài)。ESCs 具有較好的遺傳可操作性，對其進(jìn)行遺傳改造，可將其誘導(dǎo)為特定肝組織細(xì)胞。然而，ESCs在臨床研究中被證明有發(fā)生癌變導(dǎo)致畸胎瘤的可能，且其臨床應(yīng)用存在著倫理問題，因此其相關(guān)研究及應(yīng)用受到了限制［5］。

MSCs 是一類起源于中胚層間充質(zhì)的干細(xì)胞。骨髓MSCs 經(jīng)肝向誘導(dǎo)后可分化為肝樣細(xì)胞，緩解肝臟纖維化。其還可分泌白介素-10 等炎性介質(zhì)，改善急性肝衰竭的炎癥狀態(tài)，是當(dāng)前被廣泛應(yīng)用的一類干細(xì)胞。除了骨髓來源外，MSCs 還可來源于胎盤、牙髓、臍帶和脂肪等多種組織器官。由于MSCs 細(xì)胞膜表面的人類白細(xì)胞抗原Ⅰ類分子表達(dá)較少，且不表達(dá)CD40、B7 受體等T 細(xì)胞激活必需的共刺激分子，使得T 細(xì)胞不對MSCs 產(chǎn)生免疫反應(yīng)。同時(shí)，MSCs 可在移植后迅速遷移到肝臟，通過旁分泌激活肝祖細(xì)胞，促進(jìn)肝祖細(xì)胞分化為肝細(xì)胞［6］。MSCs 的安全性高，作用機(jī)制研究成熟，是目前肝損傷治療中最常用的干細(xì)胞。

iPSCs 是將分化的成體細(xì)胞重編程得到的具有胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞。iPSCs 有與ESCs 相似的增殖和發(fā)育潛能，同時(shí)規(guī)避了免疫排斥性和ESCs潛在的倫理學(xué)爭議。iPSCs可定向分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞治療肝損傷，具有多元遺傳背景的iPSCs也為疾病模擬和藥物測試提供了平臺［7］。盡管iPSCs 尚且存在肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率低、功能不成熟等問題，但隨著相關(guān)研究的進(jìn)展，iPSCs 必將在肝損傷修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮更加關(guān)鍵的作用。

除此之外，骨髓中的造血干細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞，也可遷移到肝臟內(nèi)分泌粒細(xì)胞集落刺激因子等生長因子促進(jìn)肝細(xì)胞的生長修復(fù)。但其分化產(chǎn)生的肝細(xì)胞十分有限，數(shù)量僅相當(dāng)于肝細(xì)胞總量的10-4～10-5，難以實(shí)現(xiàn)受移植者肝臟的正常更新，故在臨床上的應(yīng)用較為局限［8］。

綜上所述，肝卵圓細(xì)胞和小肝細(xì)胞樣前體細(xì)胞是應(yīng)用于肝損傷治療的兩類傳統(tǒng)干細(xì)胞，但二者功能單一、副作用大，臨床應(yīng)用較為局限。ESCs和造血干細(xì)胞則具有較為明顯的缺陷，故臨床上一般不用于治療肝臟損傷。iPSCs 和MSCs 是兩類機(jī)制明確、治療效果好、副作用小的干細(xì)胞，二者勢必將在肝損傷治療中扮演更重要的角色。肝損傷修復(fù)的廣泛干細(xì)胞來源提示了肝損傷干細(xì)胞療法的巨大潛力，但各類干細(xì)胞作用均存在一定的局限。探索干細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用方法可能是拓展其治療范圍、增強(qiáng)其治療效力的有效手段。

2 干細(xì)胞在各類肝損傷中的應(yīng)用及潛在機(jī)制

2.1 肝臟缺血再灌注損傷肝臟缺血再灌注損傷是引起術(shù)后早期肝功能不全或肝衰竭的主要原因，是肝臟外科手術(shù)、休克、創(chuàng)傷和器官移植或急性大量失血常見的并發(fā)癥。缺血再灌注損傷的發(fā)生可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、鈣通道超載等因素有關(guān)。但也有學(xué)者認(rèn)為炎癥反應(yīng)是引起肝缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素［9］。骨髓、臍帶、脂肪等多種不同來源的MSCs 對于肝臟缺血再灌注損傷均具有明顯的治療效果。MSCs 通過減少肝臟內(nèi)的炎癥水平降低肝細(xì)胞損傷，調(diào)控炎癥反應(yīng)參與肝缺血再灌注后肝細(xì)胞損傷的修復(fù)。又有研究表明MSCs 在炎癥環(huán)境內(nèi)對于中性粒細(xì)胞的趨化募集具有一定的抑制作用，提示其可通過減少中性粒細(xì)胞在肝臟內(nèi)的募集從而緩解肝臟缺血再灌注損傷［10］。MSCs 通過降低炎癥反應(yīng)來減少肝細(xì)胞損傷，作用模式較為單一，新的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探明。

2.2 酒精/非酒精性脂肪性肝炎酒精性脂肪性肝病是由酒精引起大量肝細(xì)胞壞死造成的肝功能損傷狀態(tài)。非酒精性脂肪性肝病是非酒精引起的，由“遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激”導(dǎo)致的以脂質(zhì)在肝內(nèi)沉積為主要病理特征的肝病。二者病理機(jī)制相似，病情可進(jìn)展為脂肪性肝炎、肝纖維化，最終引發(fā)肝衰竭甚至死亡［11］。MSCs可維持脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A 氧化酶等脂質(zhì)代謝相關(guān)酶類的正常水平，減少肝中脂肪的沉積。MSCs 還可促進(jìn)肝臟血紅素加氧酶的表達(dá)以降低炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介質(zhì)-6 和單核細(xì)胞趨化因子-1 的表達(dá)，緩解肝臟炎癥反應(yīng)，并抑制Toll 樣受體-4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB 炎癥通路及肝臟氧化應(yīng)激進(jìn)而修復(fù)肝功能損傷。同時(shí)，MSCs可向炎癥部位遷移，通過激活CD4+輔助性T 細(xì)胞-2 和CD4+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞來抑制CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。MSCs被證實(shí)可直接定向歸巢至受損傷的肝臟組織，通過旁分泌效應(yīng)分泌肝細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞因子抑制肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，為受損組織提供營養(yǎng)支持，誘導(dǎo)局部肝前體細(xì)胞的增殖和分化并通過改變微環(huán)境來刺激血管生成和肝組織再生［12］。代謝通路調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)控、微環(huán)境再建是干細(xì)胞治療肝炎的三種明確作用機(jī)制。

2.3 肝纖維化和肝硬化肝炎病毒、酒精、免疫反應(yīng)等致病因子持續(xù)損傷肝臟，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、內(nèi)皮屏障受損、炎癥細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞活化以及氧化應(yīng)激和成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生［13］。肝纖維化一旦發(fā)展為肝硬化，就無法通過有效的方法治療。因此，應(yīng)在肝纖維化階段給予積極治療。MSCs 可通過免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)和分泌外泌體等途徑調(diào)節(jié)肝纖維化進(jìn)程。MSCs通過抑制IFN-γ+、CD4+、IL-6+等淋巴細(xì)胞的增長，促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞的活化和基質(zhì)金屬蛋白酶-13的分泌來限制肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而減緩肝纖維化進(jìn)程。iPSCs 衍生的外泌體可用于減輕肝組織壞死程度，減弱氧化應(yīng)激來保護(hù)肝臟。在抗凋亡能力方面，經(jīng)血干細(xì)胞來源外泌體可以表達(dá)白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8、血管生成素等細(xì)胞因子改善肝功能。研究表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體在對抗丙型肝炎病毒時(shí)表現(xiàn)出有效的抗病毒活性，其所釋放的一系列miRNA 如miR-145、miR-199a 和miR-221 等可以顯著抑制丙型肝炎病毒的RNA 復(fù)制。成人肝干細(xì)胞的外泌體使肝臟細(xì)胞表面的纖維囊減少，肝組織結(jié)構(gòu)軟化，肝臟炎癥及膠原沉積減輕，能有效改善肝臟的纖維化程度［14］。

2.4 氧化應(yīng)激損傷肝臟代謝極其活躍，耗氧量大，產(chǎn)生的氧自由基較多，在肝內(nèi)積聚，造成肝臟氧化應(yīng)激損傷。肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 和DNA 過氧化產(chǎn)物8-OHdG 等有毒的過氧化物增加和抗氧化劑谷胱甘肽下降，破壞強(qiáng)氧化劑和抗氧化劑之間的平衡，進(jìn)而激活p38-MAPK 通路，啟動下游凋亡相關(guān)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體將其包裹的谷胱甘肽過氧化物酶1 等活性成分轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞，減輕了氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物對細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，提高了肝細(xì)胞的抗氧化能力。同時(shí)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠抑制P38分子磷酸化從而抑制P38-MAPK 通路的活化，避免了肝損傷的進(jìn)展［15］。

2.5 藥物性肝損傷藥物性肝損傷是指由各類化學(xué)藥物、生物制劑及其代謝產(chǎn)物等所造成的肝損傷，可導(dǎo)致急性肝衰竭的發(fā)生。藥物進(jìn)入肝細(xì)胞后與組織蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)化為抗原，激活免疫系統(tǒng)造成肝臟損傷。藥物對肝臟的損傷機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、代謝介導(dǎo)的反應(yīng)性代謝物形成、介導(dǎo)免疫反應(yīng)和造成線粒體功能障礙。MSCs 通過旁分泌生物活性因子作用于鄰近細(xì)胞來治療肝損傷。MSCs 來源的外泌體上調(diào)肝臟再生過程中啟動期相關(guān)基因，并通過增加Bcl-xL 蛋白表達(dá)來抑制肝細(xì)胞凋亡，抵抗毒物誘導(dǎo)的損傷［16］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)［17］，連接黏附因子A（junction adhesion molecule A，JAM-A）可以促進(jìn)MSCs 定向歸巢并發(fā)揮細(xì)胞因子分泌功能，并證實(shí)其在促進(jìn)創(chuàng)面皮膚愈合上的作用。通過前期實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)證明，JAM-A 可促進(jìn)MSCs 向脂多糖誘導(dǎo)肝損傷部位定向遷移，提示了MSCs 治療藥物性肝損傷的一種潛在機(jī)制。同時(shí)，MSCs 來源外泌體的非細(xì)胞系統(tǒng)避免了肝細(xì)胞移植組織不相容的風(fēng)險(xiǎn)，安全有效。

3 干細(xì)胞治療肝損傷的臨床研究與應(yīng)用

目前應(yīng)用于肝損傷治療的多為自體骨髓干細(xì)胞或組織相容性骨髓干細(xì)胞。但骨髓干細(xì)胞的獲取方式侵入性高，對機(jī)體損傷較大，且干細(xì)胞數(shù)量和分化潛力隨年齡增長下降。MSCs 是目前治療肝損傷機(jī)制最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的干細(xì)胞。MSCs 具有較低的免疫原性，且易提取，易培養(yǎng)增殖。MSCs 可從外周血、臍帶血、脂肪等多種來源獲取。臍帶血來源的MSCs，容易獲取，可供人終生受用。脂肪來源的MSCs 增殖能力強(qiáng)，組織豐度高，通過抽脂法即可分離［18］。iPSCs 具有很強(qiáng)的全能性，可分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，為肝損傷提供了新的細(xì)胞療法。然而，iPSCs 分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞功能活性較低，僅為原代肝細(xì)胞的0.3% ～10.0%［19］。盡管動物實(shí)驗(yàn)效果良好，iPSC 的致瘤性等問題仍阻礙了其在臨床上的相關(guān)應(yīng)用。

干細(xì)胞分泌的外泌體不僅可以有效治療肝病，也是肝病診斷和預(yù)后監(jiān)測的分子生物標(biāo)志。來自成人肝干細(xì)胞的外泌體可釋放具有抗腫瘤作用的miRNAs，并能誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可將miR-122 轉(zhuǎn)移到肝星狀細(xì)胞并調(diào)控其增殖，從而緩解肝纖維化進(jìn)程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體抑制細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)Hep-G2 細(xì)胞凋亡，抑制了肝癌的進(jìn)展。另外，外泌體包含的miRNA 還可以作為疾病發(fā)生和發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)志物用于疾病治療的監(jiān)測。

干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞可應(yīng)用于模擬人藥物性肝損傷。使用干細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)生人肝細(xì)胞可提高藥物誘導(dǎo)肝損傷的可預(yù)測性，并用于篩查藥物對人體的不良反應(yīng)。這是利用干細(xì)胞來源的體細(xì)胞對不同遺傳背景的人類藥物進(jìn)行修飾和提高藥物開發(fā)效率的重要一步?？稍偕?xì)胞群如ESCs 和iPSCs 等都被證明可以通過自發(fā)或定向分化的方式向肝細(xì)胞分化，在預(yù)測人類藥物性肝損傷方面表現(xiàn)出很高的準(zhǔn)確性，為藥物的毒性模擬評估和臨床試驗(yàn)提供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)［20］。相關(guān)臨床研究見表1。

表1 干細(xì)胞治療肝損傷的臨床研究Tab.1 Clinical study on stem cell therapy for liver injury

4 存在問題與展望

目前應(yīng)用于肝損傷治療的多為成體干細(xì)胞，且來源大多局限于MSCs 和其來源的外泌體。其他來源的干細(xì)胞及其損傷修復(fù)的機(jī)制與應(yīng)用有待進(jìn)一步完善。同時(shí)，長期來看，干細(xì)胞移植后，若其在體內(nèi)的生長增殖失控，則會發(fā)生成瘤風(fēng)險(xiǎn)。自體干細(xì)胞的使用不受倫理學(xué)制約，但胚胎干細(xì)胞和克隆技術(shù)等的應(yīng)用涉及到一系列社會倫理學(xué)問題。同時(shí)，臨床上干細(xì)胞的應(yīng)用尚無統(tǒng)一的安全評價(jià)機(jī)制，其應(yīng)用的流程規(guī)范和應(yīng)用療效的評估標(biāo)準(zhǔn)也有待完善。

除了干細(xì)胞的直接應(yīng)用，干細(xì)胞與基因工程學(xué)、細(xì)胞工程學(xué)及肝再生醫(yī)學(xué)等的結(jié)合為干細(xì)胞治療肝損傷提供了新的思路。目前臨床上已經(jīng)將來自自體的成體干細(xì)胞分離富集后直接進(jìn)行移植，用于代替肝移植治療肝損傷，同時(shí)避免倫理爭端。應(yīng)用基因工程學(xué)技術(shù)，對移植干細(xì)胞的基因進(jìn)行修飾，賦予干細(xì)胞新功能，又避免了免疫排斥問題，從基因?qū)用嬷委煾螕p傷。此外，肝組織工程技術(shù)有望替代肝移植或肝靶向基因治療，有效治療遺傳性肝病。由人誘導(dǎo)全能干細(xì)胞產(chǎn)生的類肝細(xì)胞是肝組織工程的細(xì)胞來源，可用于肝病的治療和藥物研究。在肝再生醫(yī)學(xué)中，干細(xì)胞構(gòu)建的生物人工肝支持系統(tǒng)可有效幫助終末期肝病患者，提高其生存率［30］。

綜上所述，不同來源的干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于多種肝損傷的治療。干細(xì)胞治療肝損傷的作用機(jī)制為進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究提供了新思路。在肝病的臨床治療上，干細(xì)胞的功能有待進(jìn)一步發(fā)掘與完善。干細(xì)胞治療與工程學(xué)、再生醫(yī)學(xué)相關(guān)方法的結(jié)合，顯示出干細(xì)胞在臨床應(yīng)用上的巨大潛力，是肝損傷的干細(xì)胞療法未來的發(fā)展方向。