黎權(quán)方，李龍寬，顧軍榮，趙月涵，陳應(yīng)強(qiáng)（.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)科，貴州 都勻 558000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院感染科，貴州 都勻 558000）

肝纖維化（liver fibrosis，LF）是慢性肝病發(fā)生發(fā)展過程中肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增加、降解相對(duì)不足引起異常沉積所發(fā)生的一種病理改變[1]。肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活[2]。多種細(xì)胞因子可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，其中血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）是一種關(guān)鍵的促HSC 激活和遷移的纖維化細(xì)胞因子，介導(dǎo)肝纖維化的進(jìn)程。隨著組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑廣泛應(yīng)用于器官纖維化及癌癥的治療[3-4]，肝纖維化的組蛋白修飾也成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)HDAC 抑制劑可延緩肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展，調(diào)控肌纖維細(xì)胞活化、增殖和ECM 蛋白的生成，通過染色質(zhì)重塑等減輕腎臟纖維化的發(fā)生[5-7]。伏立諾他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA），是一種廣譜HDAC 抑制劑，本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察伏立諾他對(duì)PDGF 刺激的HSC-T6 的增殖、遷移及細(xì)胞周期相關(guān)基因、蛋白和COLⅠ的影響，考察其抗肝纖維化作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞

大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6 [Merck（中國(guó)），貨號(hào)：SCC069]。

1.2 試藥

DMEM/高糖培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco 公司）；PDGF-BB（日本Takara 公司）；伏立諾他（貨號(hào)：SML0061，規(guī)格：5 mg，白色粉末，分子量：264.32，Sigma 公司）；胰蛋白酶、RIPA緩沖液（美國(guó)Sigma 公司）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）；甲醇（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液定制中心）；Trizol（日本Takara 公司）；Bestar RT-qPCR kit 及Bestar RT-qPCR MasterMix（DBI 公司）；一抗稀釋液、二抗稀釋液、SDS-PAGE、PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司）；COLⅠ抗體、CyclinD1、CyclinE1 抗體（美國(guó)Abcam 公司）；GAPDH 抗體（美國(guó) Santa Cruz Biotechnology 公司）。

1.3 儀器

離心機(jī)（廣州吉帝儀器有限公司）；－80 ℃超低溫冰箱（海信容聲冰箱有限公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、電泳槽（美國(guó)BIO-RAD）；酶標(biāo)儀（華泰和合商貿(mào)有限公司）；恒溫振蕩器（日本Asone）；電泳儀（六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6 分為3 組：空白對(duì)照組（不做任何處理）、模型組（加入10 ng·mL－1PDGF-BB）[8]、伏立諾他組（先以10 ng·mL－1PDGF-BB 刺激30 min，再加入100 nmol·L－1伏立諾他作用72 h[9]）。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將“2.1”項(xiàng)下不同組HSC-T6 接種于96 孔板中培養(yǎng)過夜。在24、48 和72 h 在酶孔中加入10 μL CCK-8 溶液10 min 后，在450 nm 測(cè)定吸光度。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力

收集經(jīng)“2.1”項(xiàng)下方法處理后的HSC-T6，加入80%的冷乙醇。洗滌后，用50 μL·mL－1PI在4 ℃暗光下染色過夜。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后的HSC-T6 的細(xì)胞周期。

2.4 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

收集經(jīng)“2.1”項(xiàng)下方法處理后的細(xì)胞，加入RIPA 緩沖液分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。用含5%脫脂牛奶封閉后，把膜與相應(yīng)的一抗4 ℃ 溫育過夜。最后與二抗在室溫下孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影蛋白質(zhì)。以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白對(duì)各蛋白進(jìn)行定量，蛋白表達(dá)水平以各組COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的灰度值除以對(duì)應(yīng)的內(nèi)參蛋白灰度值表示。

2.5 RT-qPCR 檢測(cè)基因表達(dá)量

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HST-6 細(xì)胞接種于75 mL 培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí)，加入PDGF-BB誘導(dǎo)30 min，加入含有伏立諾他100 nmol·L－1的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用Trizol 提取總RNA，用Bestar RT-qPCR 試劑盒合成cDNA，最后用Bestar RT-qPCR Master Mix 測(cè)定基因表達(dá)，用2－△△Ct法確定基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用重復(fù)檢測(cè)方差分析、單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 伏立諾他對(duì)PDGF-BB 誘導(dǎo)的HSC-T6 增殖作用的影響

與空白對(duì)照組相比，加入PDGF-BB 對(duì)HSC-T6 的增殖有明顯刺激作用；與模型組比較，伏立諾他能抑制PDGF-BB 刺激的HSC-T6 增殖，結(jié)果見表1。

表1 伏立諾他對(duì)PDGF-BB 刺激的HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Tab 1 Effect of vorinostat on HSC-T6 proliferation stimulated by PDGF-BB (±s，n ＝3)

表1 伏立諾他對(duì)PDGF-BB 刺激的HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Tab 1 Effect of vorinostat on HSC-T6 proliferation stimulated by PDGF-BB (±s，n ＝3)

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the blank control group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 光密度值24 h 48 h 72 h空白對(duì)照組 0.432±0.054 0.555±0.168 0.817±0.365模型組 0.508±0.136 a 0.821±0.277 a 1.311±0.156 a伏立諾他組 0.423±0.182 b 0.601±0.136 b 0.792±0.207 b

3.2 流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果

PDGF-BB 的激活顯著降低了G0/G1期HSC-T6，增加了S 期HSC-T6，而伏立諾他治療可以顯著逆轉(zhuǎn)G0/G1期和S 期HSC-T6 數(shù)量的變化，提示伏立諾他通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖（見圖1）。

圖1 各組HSC-T6 細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的情況Fig 1 Apoptosis of HSC-T6 cells in each group

3.3 Western blot 結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，模型組中COLⅠ、CyclinD1和CyclinE1 的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；伏立諾他干預(yù)后，COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）（見表2 及圖2）。提示伏立諾他能顯著下調(diào)PDGF-BB 激活的HSC-T6 細(xì)胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的表達(dá)。

表2 HSC-T6 細(xì)胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白相對(duì)灰度值(±s，n ＝3)Tab 2 Relative gray value of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells (±s，n ＝3)

表2 HSC-T6 細(xì)胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白相對(duì)灰度值(±s，n ＝3)Tab 2 Relative gray value of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells (±s，n ＝3)

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the blank control group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 相對(duì)灰度值COLⅠ CyclinD1 CyclinE1空白對(duì)照組 0.2980±0.0022 0.1961±0.0050 0.2154±0.0196模型組 0.7323±0.0264a 0.7433±0.1003a 0.5386±0.1940a伏立諾他組 0.5700±0.2053b 0.4972±0.1746b 0.3861±0.2132b

圖2 HSC-T6 細(xì)胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白表達(dá)情況Fig 2 Expression of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells

3.4 RT-qPCR 結(jié)果

所有引物的序列如表3 所示。與空白對(duì)照組相比，模型組中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；加入伏立諾他后，COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）（見表3 及圖3），提示伏立諾他可以抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的HSC-T6 表 達(dá)COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1。

圖3 HSC-T6 細(xì)胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的mRNA 的表達(dá)情況Fig 3 Expression of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 mRNA in HSC-T6 cells

4 討論

肝纖維化的主要特征是長(zhǎng)期慢性肝臟損傷，導(dǎo)致靜息狀態(tài)下HSC 的活化并轉(zhuǎn)變成肌成纖維樣細(xì)胞，獲得增殖并表達(dá)PDGF 等相關(guān)細(xì)胞因子的能力，使大量ECM 過度沉積。HSC 的活化受多種因素影響，其中PDGF 被認(rèn)為是最強(qiáng)的促有絲分裂因子[10-11]。PDGF 可以與HSC 表面的PDGF 受體結(jié)合，促進(jìn)HSC 的活化、增殖，介導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生[12]。細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下，G1期CyclinD表達(dá)增多，CyclinE 可促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S 期的限制點(diǎn)進(jìn)入S 期[13]。ECM 的合成主要以Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原為主，其中Ⅰ型膠原約占60%，因此Ⅰ型膠原的表達(dá)水平可視為判斷ECM 合成的重要指標(biāo)[12]。所以，抑制HSC 的活化、增殖，促進(jìn)凋亡，抑制過多的ECM 沉積成為肝纖維化防治的重要思路。組蛋白乙?；c肝纖維化的發(fā)生關(guān)系密切，組蛋白乙?；瘏⑴c在轉(zhuǎn)錄后HSCs 的活化、增殖和凋亡的調(diào)控。盡管目前已開發(fā)出大量HDAC 抑制劑，但還沒有有效的藥物治療人類肝纖維化。本課題以激活型的HSC-T6 為研究對(duì)象，PDGF 作為誘導(dǎo)因子，觀察伏立諾他抑制HSC-T6 的作用，發(fā)現(xiàn)伏立諾他可顯著逆轉(zhuǎn)G0/G1期和S 期HSC-T6 數(shù)量的變化，提示伏立諾他可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的HSC-T6 的增殖，促進(jìn)HSC-T6 的凋亡，抑制HSC-T6 細(xì)胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白及mRNA 的表達(dá)。這為伏立諾他臨床抗肝纖維化的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

表3 COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的引物序列Tab 3 Primer sequences of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1