鄭 元 羅婭娜 羅瑪妮婭 張 璋 王 毅

（1. 云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650233）

在真核生物中，氧化角鯊烯環(huán)化酶家族（OSCs）可催化2,3-氧化角鯊烯（OS）發(fā)生不同類型的環(huán)化作用，在動(dòng)植物和真菌中分別合成麥角甾醇和膽固醇以及植物甾醇等不同碳架的三萜類化合物[1]。在真菌三萜化合物的合成過(guò)程中，角鯊烯合成酶（SQS）、角鯊烯環(huán)氧酶（SE）和羊毛甾醇合成酶（LSS）都是影響其生物合成的關(guān)鍵酶。第1步，由SQS將異戊二烯通路中的碳通量引至三萜生物合成通路，催化2分子法呢基焦磷酸（FPP）縮合產(chǎn)生角鯊烯；第2步，由SE催化角鯊烯合成三萜和甾醇的共同前體物質(zhì)OS；第3步，由羊毛甾醇合成酶（LSS）催化OS經(jīng)一系列的環(huán)化反應(yīng)生成四環(huán)結(jié)構(gòu)的羊毛甾醇；最后，由麥角甾醇合成相關(guān)的一系列酶催化羊毛甾醇最終轉(zhuǎn)化形成麥角甾醇[2]。在這一系列的合成過(guò)程中，由LSS催化的OS環(huán)化反應(yīng)是麥角甾醇和三萜化合物生物合成的關(guān)鍵分支位點(diǎn)，因此通過(guò)對(duì)編碼2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶或羊毛甾醇合成酶的基因進(jìn)行調(diào)控，可以調(diào)節(jié)OS最終流向麥角甾醇代謝途徑的比例[3]。目前，羊毛甾醇合成酶基因已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、粗莖鱗毛蕨（Dryopteris crassirhizoma）[4]、人參（Panax ginseng）[5-6]等多種植物中被分離鑒定，但在牛樟芝（Antrodia cinnamomea）中LSS基因還鮮有報(bào)道。

牛樟芝又名牛樟菇，是多孔菌科（Fomitopsidaceae）薄孔菌屬的真菌。常寄生在百年牛樟樹（Cinnamomum kanehirai）腐朽樹干的心材內(nèi)壁或是其潮濕的木材表面，故野生牛樟芝一般難以獲得[7-10]。牛樟芝中含有三萜、多糖、馬來(lái)酸衍生物等300多種有效成分，是一種高價(jià)值的藥用真菌。其中牛樟芝的三萜化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗過(guò)敏、抑制血小板凝集等多種生理活性，同時(shí)還可增強(qiáng)免疫力、有效地預(yù)防各種心血管疾病[11-18]。本研究對(duì)牛樟芝三萜類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶基因AcLSS進(jìn)行克隆，探究不同培養(yǎng)添加物對(duì)其表達(dá)情況的影響，有利于深入地了解牛樟芝三萜類化合物的合成途徑，為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1）實(shí)驗(yàn)材料：牛樟芝AC001由云南省林業(yè)和草原科學(xué)院提供，經(jīng)過(guò)ITS鑒定，具體的培養(yǎng)條件和取樣方法參照原曉龍等[19]對(duì)牛樟芝actri5基因的克隆與最佳表達(dá)培養(yǎng)基的篩選。

2）實(shí)驗(yàn)試劑：RNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)有限公司）、HiFi-DNA聚合酶（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、引物（AcLSSF0、AcLSSR0、TAcLSSF、TAcLSSR）、載體（pUMT） （上海生工生物工程股份有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（北京康為世紀(jì)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Super RT）等。

1.2 AcLSS基因的克隆

對(duì)牛樟芝的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)，以繡球菌（Sparassis crispa，XP_027617410.1）的LSS基因?yàn)樘讲樾蛄?，比?duì)得到目標(biāo)序列，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異性引物AcLSSF0、AcLSSR0（表1）。采用RNA試劑盒（康為世紀(jì)，CW0559，https://www.cwbiotech.com/goods/index/id/10205）提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA，具體方法參見說(shuō)明書；以cDNA為模板，AcLSSF0、AcLSSR0為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增體系進(jìn)行檢測(cè)并取目的條帶，目的條帶經(jīng)回收純化后連接到pUMT載體上，采用菌落PCR技術(shù)進(jìn)行篩選，將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表 1 克隆體系的引物序列Table 1 The primer sequences of clone systems

1.3 AcLSS基因的序列分析

將AcLSS的測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，并對(duì)其cDNA序列和氨基酸序列從理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位和功能域等方面進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，并選擇同源性較高的真菌LSS蛋白序列進(jìn)行聚類分析。其中，理化性質(zhì)分析借助于ProParam在線工具（https://web.expasy.org/protparam/），信 號(hào) 肽 預(yù) 測(cè)用SignalP 4.1 server（https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），跨膜結(jié)構(gòu)分析用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM），細(xì)胞定位采用TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)則利用Structure/cdd（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）[10]。

1.4 AcLSS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將AcLSS蛋白進(jìn)行BLAST在線比對(duì)后，選擇一致性較高的真菌LSS蛋白與其進(jìn)行多序列比對(duì)。采用MEGA7.0的Clustal W程序進(jìn)行，構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)應(yīng)用鄰位相接法，在自展分析中重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000次，其他均采用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行繪制。

1.5 AcLSS基因的表達(dá)分析

選擇適于牛樟芝生長(zhǎng)的培養(yǎng)基作為研究AcLSS基因的配方（表2）。分別將牛樟芝菌絲體接種在1～13號(hào)培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)40 d后，從各培養(yǎng)基上取適量菌絲體提取總RNA，設(shè)置3次重復(fù)。利用總RNA合成cDNA，以actin作為內(nèi)參，以TAcLSSF、TAcLSSR為引物，分別檢測(cè)AcLSS在不同水平下的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)束后，用GENE-SNAPS分析各條帶的積分光密度值，以此作為相對(duì)表達(dá)量繪制柱狀圖，對(duì)凝膠電泳圖像進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表 2 不同添加物的培養(yǎng)基Table 2 The mediums with different additives

2 結(jié)果與分析

2.1 AcLSS基因全長(zhǎng)分析

以牛樟芝的cDNA為模板，以AcLSSF0、AcLSSR0為特異性引物，得到牛樟芝羊毛甾醇合成酶基因（AcLSS）的全長(zhǎng)cDNA，通過(guò)比對(duì)其基因組DNA與cDNA序列發(fā)現(xiàn)其含有8個(gè)內(nèi)含子（從起始密碼子開始依次為424～471、690～749、885～938、1 572～1 626、1 773～1 821、1 927～1 979、2 202～2 261、2 409～2 469）、9個(gè)外顯子（圖1）。AcLSS基因的開放閱讀框?yàn)? 205 bp，編碼734個(gè)氨基酸殘基。將AcLSS蛋白序列在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與繡球菌（S. crispa，XP_027617410.1）的羊毛甾醇合成酶蛋白的同源性為99%，一致性達(dá)80.52%。

2.2 AcLSS基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)預(yù)測(cè)AcLSS蛋白序列的理化性質(zhì)可知：分子式為C3824H5753N1017O1076S37；其相對(duì)分子質(zhì)量為84.38 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為6.13，主要氨基酸包括Ala、Glu、Gly、Leu等；負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp + Glu）總數(shù)為82個(gè)，正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys）為70個(gè)；脂肪族系數(shù)為77.07；不穩(wěn)定指數(shù)為45.46，屬于不穩(wěn)定蛋白。AcLSS蛋白不存在信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。將AcLSS蛋白序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）上進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與繡球菌（XP_027617410.1）、褐腐擔(dān)子菌（Postia placenta，XP_024340992.1）、玫瑰色擬層孔菌（Fomitopsis rosea，TFY51879.1）、茯苓（Wolfiporia cocos，ALM02366.1）的LSS蛋白序列一致性分別為80.52%、75.88%、78.61%、79.43%。通過(guò)其蛋白序列分析可知，該蛋白存在由14個(gè)氨基酸和6個(gè)氨基酸組成的高度保守序 列“KGAWPFSTKTQGYT”、“VSDCTG”，以及由16個(gè)氨基酸組成的OSC保守結(jié)合域“KACNFLISKQRSDGGW”（圖2）。

圖 1 AcLSS基因的內(nèi)含子和外顯子Fig. 1 The introns and exons of AcLSS gene in A. cinnamomea

圖 2 牛樟芝LSS蛋白與其他真菌LSS蛋白序列比對(duì)分析Fig. 2 The proteinic sequences alignment of LSS in A. cinnamomea with other related fungus proteins

2.3 AcLSS蛋白分子系統(tǒng)進(jìn)化

將牛樟芝AcLSS蛋白與其他11條真菌LSS蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)后，繪制出分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示：松生擬層孔菌（Fomitopsispinicola，EPT00921.1）、櫟迷孔菌（Daedalea quercina，KZT70711.1）、根纖維孔菌（Fibroporia radiculosa，XP_012179653.1）、硫 磺 多 孔 菌（Laetiporus sulphureus，KZT09915.1）、擬 蠟 菌（Obba rivulosa，OCH91004.1）、蟲 擬 蠟 菌（Gelatoporia subvermispora，EMD38881.1）等多孔菌科的真菌聚為一支；（Hydnomerulius pinastri，KIJ65724.1）、干 腐 菌（Serpula lacrymans，XP_007320669.1）、褐腐擔(dān)子菌（P. placenta，XP_024340992.1）、牛 樟 芝（A.cinnamomea）等真菌聚為一支；紫蠟?zāi)ⅲ↙accaria amethystina，KIK07789.1）和乳白蛋巢菌（Crucibulum laeve，TFK39425.1）聚為一支。其中，牛樟芝與褐腐擔(dān)子菌的AcLSS蛋白親緣關(guān)系最近。

圖 3 牛樟芝AcLSS蛋白與其他真菌相關(guān)蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 The phylogenetic tree of AcLSS in A. cinnamomea with other related LSS proteins in different fungi

2.4 AcLSS基因的表達(dá)水平檢測(cè)

以肌動(dòng)蛋白為參照，以TAcLSSF、TAcLSSR為引物，分別檢測(cè)AcLSS基因在不同培養(yǎng)基上的表達(dá)情況，誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示：在不同的培養(yǎng)條件下，AcLSS基因的表達(dá)量差異顯著。以甘露醇為碳源和番茄浸粉為氮源時(shí)，該基因的誘導(dǎo)表達(dá)量最高（圖4）。

圖 4 不同添加物對(duì)AcLSS的誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 4 The inducible expression of AcLSS gene in A. cinnamomea cultivated in different additives

3 結(jié)論與討論

牛樟芝中的三萜類化合物作為一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，是通過(guò)甲羥戊酸（MVA）代謝途徑，經(jīng)羊毛甾醇等中間體，經(jīng)過(guò)一系列氧化還原以及環(huán)化反應(yīng)形成的。羊毛甾醇合成酶是OSC家族的一個(gè)重要成員，在MVA途徑中的第2個(gè)分支點(diǎn)上發(fā)揮重要作用，是牛樟芝三萜類化合物合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。羊毛甾醇合成酶可催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成羊毛甾醇，其含量以及活性的高低會(huì)影響麥角甾醇的產(chǎn)量，而麥角甾醇和羊毛甾醇是牛樟芝三萜化合物的兩種主要骨架，占據(jù)總?cè)平Y(jié)構(gòu)比例的63%[20]。

本研究對(duì)牛樟芝AcLSS基因的理化性質(zhì)、細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)等方面的研究結(jié)果與前人基本一致。通過(guò)蛋白比對(duì)發(fā)現(xiàn)AcLSS蛋白存在由14個(gè)氨基酸和6個(gè)氨基酸組成的高度保守特征序 列“KGAWPFSTKTQGYT”、“VSDCTG”，以及由16個(gè)氨基酸組成的OSC保守結(jié)合域“KACNFLISKQRSDGGW”。由此可見，羊毛甾醇合成酶基因及其功能蛋白在整個(gè)分子進(jìn)化過(guò)程中高度保守。分子系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，AcLSS蛋白與褐腐擔(dān)子菌的LSS蛋白親緣關(guān)系最近；表達(dá)譜結(jié)果顯示，不同碳、氮源添加物對(duì)牛樟芝AcLSS基因的誘導(dǎo)表達(dá)量差異明顯。在不同碳源中，誘導(dǎo)表達(dá)量依次為甘露醇＞果糖＞葡萄糖；不同氮源中，則表現(xiàn)為番茄浸粉＞土豆蛋白胨＞酵母提取物。趙能等[21]研究發(fā)現(xiàn)牛樟芝菌絲體在不同碳、氮源添加物的培養(yǎng)基上菌絲體的長(zhǎng)勢(shì)和形態(tài)上存在較大差異，表明牛樟芝對(duì)不同碳氮源添加物的利用范圍較廣，但在利用效率上差異明顯。原曉龍等[22]對(duì)牛樟芝3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在添加不同碳源的培養(yǎng)基上，表達(dá)量依次為果糖＞甘露醇＞乳糖；在不同氮源添加物的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)表達(dá)量依次為酪蛋白胨＞土豆蛋白胨＞牛肉浸粉。結(jié)合本研究的結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，碳源添加物中的甘露醇和果糖以及氮源添加物中的土豆蛋白胨的誘導(dǎo)表達(dá)力一直保持較好的水平，這也為未來(lái)通過(guò)調(diào)節(jié)特定化合物含量來(lái)誘導(dǎo)目的基因過(guò)表達(dá)的工作提供切實(shí)的參考。

近年來(lái)，隨著牛樟芝良好的藥理作用被不斷地研究和挖掘，其人工培養(yǎng)技術(shù)在福建、云南、江西、浙江、遼寧等地逐漸興起。人工培養(yǎng)的主要方法有椴木栽培法、固體培養(yǎng)法、液體發(fā)酵法和皿培法。不同的培養(yǎng)方法對(duì)牛樟芝中化學(xué)成分的含量和種類有一定影響。其中，椴木培養(yǎng)法所獲得的產(chǎn)物與野生牛樟芝成分最為相似，但由于其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，未被廣泛采用；另外3種培養(yǎng)方法因周期短、產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì)已得到推廣應(yīng)用[23]。然而，在自然條件下，牛樟芝的生長(zhǎng)十分緩慢，而又因其含有較多的活性物質(zhì)，一度造成供不應(yīng)求的市場(chǎng)現(xiàn)狀。本研究通過(guò)對(duì)牛樟芝三萜類化合物MVA合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因AcLSS進(jìn)行克隆以及探究其在不同碳氮源培養(yǎng)基上的表達(dá)情況，以期為牛樟芝三萜化合物合成酶表達(dá)機(jī)制的研究提供參考；同時(shí)，為異源表達(dá)提取牛樟芝三萜化合物的工作奠定基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)特定基因的誘導(dǎo)，明確能夠增加最終產(chǎn)物的化合物，最終達(dá)到增加下游三萜化合物產(chǎn)量的目的。