何承忠吳治洋沈德周甘沛華周安佩縱 丹

（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650233；2.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，云南 昆明 650233；3.西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650233）

云南松（Pinus yunnanensis）是云南省主要森林植被類型，也是云南的先鋒造林樹種，分布面積占云南省國土面積的29.98%，占全省林地面積的52%，占有林地蓄積的32%[1]，在云南省經(jīng)濟建設(shè)、社會發(fā)展和生態(tài)建設(shè)等方面發(fā)揮著舉足輕重的作用[2]。然而，因為大量云南松造林粗放，良莠不齊，衰退問題突出，有超過2/3的云南松林分中分布有大量扭曲型云南松（樹干既扭曲又彎曲），特別在滇中地區(qū)的次生林或人工純林中表現(xiàn)尤為突出[3-4]。由于云南松樹干扭曲嚴重，影響了樹體的生長和木材的利用價值，極大地降低了云南松林分的質(zhì)量[1,5]。干形遺傳改良是獲得材積增益的主要措施之一，在林木遺傳改良研究中占有重要地位[6-7]，而云南松干形發(fā)生扭曲現(xiàn)象的生物學(xué)機制還不清楚。為此，本研究利用SRAP分子標記技術(shù)，對采集于6個居群共180份不同干形云南松進行遺傳分析，并將不同干形云南松的特有差異條帶進行克隆測序及BLAST功能預(yù)測，為今后云南松優(yōu)良種質(zhì)資源的早期選擇提供可靠的遺傳背景信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

直干形和扭曲形云南松樣本分別采集于大理州鶴慶縣、麗江市玉龍縣、大理州劍川縣、大理州云龍縣、楚雄州永仁縣和昆明市祿勸縣直干形和扭曲形混雜分布的6個居群，每個居群內(nèi)采集15株直干形和15株扭曲形（扭角＞20°）云南松的新鮮幼嫩針葉，用變色硅膠快速干燥保存，帶回實驗室待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 總DNA提取

將充分干燥后的針葉用冷凍混合球磨儀進行研磨至粉末狀，采用HiPure SF Plant DNA Kit提取各樣本基因組總DNA；用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測儀進行質(zhì)量檢測，并將DNA濃度稀釋至50 ng/μL。

1.2.2 SRAP分子標記分析

從180份分析樣本中，隨機挑選扭曲形和直干形樣本各5個，用于SRAP標記引物篩選。共合成208對SRAP引物，采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠法進行PCR產(chǎn)物分離，挑選擴增條帶清晰，位點分布均勻，且在扭曲形和直干形樣本中條帶數(shù)目差異較大的引物組合，經(jīng)熒光標記后，采用毛細管電泳法進行所有樣本的SRAP標記分析。毛細管電泳結(jié)果表明，扭曲形或直干形云南松具有特有差異條帶的引物組合PCR產(chǎn)物，應(yīng)用6%變性聚丙烯酰胺凝膠法進行PCR產(chǎn)物分離，從中回收特有差異條帶用于測序分析。

SRAP擴增反應(yīng)體系為25 μL，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，36 ℃退火30 s，72 ℃體延伸90 s，5次循環(huán)；94 ℃變性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃體延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增結(jié)束后，在PCR擴增產(chǎn)物中加入5 μL溴酚藍指示劑，短暫離心，95 ℃變性5 min后立即置于冰中待用。6%變性聚丙烯酰胺凝膠預(yù)電泳（85 W）30 min后吸取8 μL已變性的選擇性擴增產(chǎn)物，（70 W）電泳分離，當溴酚藍指示劑泳動到玻璃板下沿時停止電泳。電泳緩沖液為1×TBE。參照Tixier等[8]銀染法顯影，采集SRAP條帶。

1.2.3 不同干形云南松特異片段回收及克隆

電泳顯影后的聚丙烯酰胺凝膠膠板于室溫晾干后，用手術(shù)刀片將不同干形云南松特有差異片段切割并從膠板剝離，收集于200 μL離心管。用100 μL ddH2O清洗3次，溶于50 μL ddH2O，10 000 r/min離心2 min，吸收上清液于1.5 mL離心管。取1 μL特異條帶回收液作為模板，按照上述體系再次進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選條帶清晰、無雜帶、無污染的PCR產(chǎn)物，參照Takara生物科技有限公司生產(chǎn)的pMD18?T vector試劑盒使用說明書進行連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)。連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用pMD18?T載體通用引物對單克隆菌液進行PCR擴增，從而進行陽性檢測。挑選條帶亮，無非特異性擴增的菌液樣本，送往昆明碩擎生物有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用GeneMarker V2.2.0軟件將毛細管電泳結(jié)果的峰值圖轉(zhuǎn)化為0/1矩陣，同一位點有峰值則標記為“1”，無峰值標記為“0”。采用POPGENE 1.32軟件計算多態(tài)性條帶數(shù)（P），多態(tài)帶百分率（PPB），觀測等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），Nei's基因多樣性指數(shù)（H），Shannon's信息指數(shù)（I），基因流（Nm），遺傳分化系數(shù)（Gst）及遺傳一致度（genetic identity）。采用NTsys 2.10e軟件進行不同居群及不同干形云南松的聚類分析，采用AMOVA軟件進行主坐標軸分析。將特有差異條帶序列應(yīng)用MEGA 5.0軟件進行序列信息分析，剔除pMD18?T載體序列后，將目的片段序列在NCBI和Uniprot網(wǎng)站（https://www.uniprot.org）進行BLAST同源性和相似性對比，查找相似基因和蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP引物擴增結(jié)果

從208對SRAP引物組合中，共篩選出PCR擴增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合14對。云南松180份樣本的14對引物組合毛細管電泳結(jié)果顯示，共分離得到584條帶，其中公共條帶33條，多態(tài)性條帶551條，多態(tài)帶百分率為94.35%。E?GCC/M?AAT引物組合擴增出的條帶數(shù)最多，為53條，E?AAC/M?CGG引物組合擴增出的條帶最少，為27條，每對引物組合平均擴增條帶數(shù)為41.7條。多態(tài)帶百分率變幅在83.33%～98.11%之間，分別對應(yīng)的引物組合是E?AAT/M?ATA和E?AAC/M?ACC，平均每對引物組合擴增得到多態(tài)性條帶數(shù)為39.4條（表1）。

2.2 遺傳基礎(chǔ)差異分析

不同干形云南松遺傳基礎(chǔ)差異分析結(jié)果見表2。由表2可知，在物種水平上，云南松180份樣本多態(tài)帶百分率為94.35%，觀測等位基因數(shù)（Na）為1.948 18，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.190 9，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon's信息指數(shù)（I）分別為0.295 7和0.451 4，表明云南松具有豐富的遺傳變異基礎(chǔ)。

從云南松不同干形水平來看，Na范圍為1.683 2～1.861 3，最高者是云龍居群直干形（YS，Na=1.861 3），最低者是鶴慶居群扭曲形（HT，Na=1.683 2）；Ne的范圍為1.365 5～1.454 1，最高的是劍川居群扭曲形（JT，1.454 1），最低的是鶴慶居群直干形（HS，1.365 5）；H介于0.218 1～0.268 7，分別為云龍扭曲形HYT=0.268 7，鶴慶直干形HHS=0.218 1；I介于0.332 5～0.410 1，最高的是云龍直干形IYS=0.410 1，最 低 的 是 鶴 慶 直 干 形HIS=0.332 5。扭曲形云南松和直干形云南松的平均多態(tài)百分率（PPB）、Na、Ne、H、I分別為94.18和93.57，1.941 8和1.935 7，1.480 0和1.463 9，0.290 0和0.282 9，0.444 0和0.435 5，各項指標中，扭曲形云南松均大于直干形。表明6個居群內(nèi)的不同干形云南松遺傳差異較豐富，且不同居群間的扭曲形云南松遺傳變異水平更高。

表 1 SRAP引物組合擴增結(jié)果Table 1 The amplified results of SRAP primer combinations

在居群水平上，6個云南松居群的平均多態(tài)性條帶百分率為92.60%，其中鶴慶居群多態(tài)條帶最低（90.79%），而云龍居群的多態(tài)性條帶百分率最高（93.84%）。鶴慶居群的Na、Ne、H、I均為最低值，分別為1.907 9、1.451 6、0.270 3和0.414 4，云龍居群的Na最高，為1.938 4，而Ne、H、I的最大值均出現(xiàn)在劍川居群，分別為1.487 2、0.290 4和0.441 8。以H為指標，從大到小依次為劍川居群＞云龍居群＞麗江居群＞永仁居群＞祿勸居群＞鶴慶居群。

表 2 云南松遺傳基礎(chǔ)差異比較Table 2 Comparison on genetic variation ofP. yunnanensis

2.3 遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳分化系數(shù)（Gst）是指居群間的變異與總變異的比值，反映了變異的主要來源；基因流（Nm）反映的是居群間基因的交流程度。利用POPGENE 1.32軟件分別計算干形間和居群間云南松的Gst和Nm，結(jié)果見圖1。以居群為單元，云南松Gst為0.097 3，Nm為4.640 6，表明不同居群間云南松遺傳分化較小，基因交流程度高，遺傳差異主要發(fā)生在居群內(nèi)不同個體間。以干形為單元，6個居群間的直干形和扭曲形云南松Gst和Nm分 別 為0.157 3和2.678 7；90株 扭 曲 形和90株直干形云南松之間的Gst和Nm分別為0.008 7和56.700 2，2種分析結(jié)果均表明，在干形水平上，扭曲形和直干形云南松分化較小，基因交流頻繁，遺傳差異主要來自于干形內(nèi)的不同個體間。

圖 1 云南松居群水平和干形水平的遺傳分化系數(shù)和基因流Fig.1GstandNmofP. yunnanensisat the levels of populations and stem forms

2.4 遺傳相似系數(shù)與聚類分析

居群間不同干形云南松的遺傳相似系數(shù)處于0.886 3～0.968 4（表3），云龍居群扭曲形（YT）與直干形云南松（YS）之間遺傳相似系數(shù)最高，而祿勸居群扭曲形云南松（QT）與鶴慶居群扭曲形云南松（HT）之間遺傳相似系數(shù)最低。從兩兩之間遺傳系數(shù)來看，祿勸居群扭曲形云南松（QT）與其他居群2種干形云南松之間的遺傳相似系數(shù)較低，尤其與鶴慶居群扭曲形（HT）、直干形（HS）、永仁居群扭曲形（RT）的遺傳相似系數(shù)均低于0.9，表明祿勸居群扭曲形云南松（QT）與其他居群云南松遺傳相似程度低，親緣關(guān)系較遠。而云龍居群直干形（YS）與其居群扭曲形，以及其余居群云南松之間的遺傳相似系數(shù)均高于0.9，且與劍川居群扭曲形（JT）和直干形（JS）、祿勸居群直干形（QS）、云龍居群扭曲形云南松（YT）之間的遺傳相似系數(shù)均高于0.95，說明云龍居群直干形云南松（YS）與其余測試分析云南松之間的親緣關(guān)系較近。

表 3 云南松6個居群不同干形間遺傳相似系數(shù)Table 3 Coefficient of genetic similarity among stem forms from 6 populations ofP. yunnanensis

進一步基于6個居群不同干形云南松遺傳相似系數(shù)進行UPGMA聚類分析，由圖2可知，以0.93為閾值，可將6個居群不同干形云南松聚分為2個大組，第1大組由劍川居群、祿勸居群及云龍居群的扭曲形和直干形云南松組成，第2大組由鶴慶居群、永仁居群及麗江居群的扭曲形和直干形云南松構(gòu)成。利用AMOVA軟件對6個居群不同干形云南松進行主成分分析（圖3），其分析結(jié)果與UPGMA聚類分析結(jié)果一致，劍川居群、祿勸居群及云龍居群的扭曲形和直干形云南松緊密地分布在一起，說明親緣關(guān)系較近，而鶴慶居群、永仁居群及麗江居群的扭曲形和直干形云南松較松散地處于另一組，表明遺傳差異相對較大。

基于遺傳相似系數(shù)的云南松6個居群UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，以相似系數(shù)0.96為閾值，云南松6個居群聚分為2個分支，第1分支由鶴慶居群、永仁居群和玉龍居群構(gòu)成，第2分支包含了劍川居群、祿勸居群和云龍居群（圖4）。聚類分析結(jié)果與云南松6個居群分布的地理距離不一致，表明地理距離不是影響云南松6個居群遺傳分化的主要因素。

圖 2 6個居群不同干形云南松聚類圖Fig.2 Dendrogram among stem forms from 6 populations ofP. yunnanensis

圖 3 6個居群不同干形云南松主成分分析Fig.3 Principal coordinates analysis for stem forms among 6 populations ofP. yunnanensis

圖 4 6個居群云南松聚類圖Fig.4 Dendrogram of 6 populations ofP. yunnanensis

2.5 不同干形特有差異片段同源性分析

在14對SRAP引物擴增產(chǎn)物中，篩選出30條扭曲形和直干形云南松特有差異條帶進行割膠回收，其中扭曲形云南松特有條帶23條，直干形云南松特有差異條帶7條。以特有差異條帶溶解液為模板進行PCR擴增后，將PCR產(chǎn)物與pMD?18?T進行連接、轉(zhuǎn)化，挑選白斑PCR擴增測序，成功獲得26條帶DNA序列，其中扭曲形云南松21條，直干形云南松5條。目的片段序列長度在152～426 bp之間，將26個特異片段序列在NCBI網(wǎng)站進行核酸BLAST對比，均對比到同源序列，相似度范圍在79%～100%。扭曲形云南松特有條帶5?T1、9?T1、10?T1與火炬松UMN_2204_01未知基因同源，相似度在82%～83%；4?T1、7?T1、8?T1、8?T2、9?T2、10?T2、14?T1

和14?T2共8條扭曲形云南松特有條帶及直干形云南松特有條帶9?S2的序列與火炬松7個功能基因同源，相似度在79%～90%；扭曲形云南松特有條帶1?T1、1?T2、1?T3、6?T1、11?T3、11?T4、12?T1和14?T3及直干形云南松特有條帶6?S1、14?S2與細菌rRNA 16S高度同源，相似度達99%～100%；扭曲形云南松特有條帶11?T2、12?T2和直干形云南松特有條帶1?S3、3?S1序列與水氣單胞菌屬DfrA17基因同源，相似度100%（表4）。

表 4 不同干形云南松特有差異條帶序列的核酸BLAST同源性對比Table 4 Nucleic acid homology comparison of unique different band sequences among different stem forms ofP. yunnanensis

續(xù)表 4

將比對到同源基因的26條序列在Uniprot網(wǎng)站（https://www.uniprot.org）進行蛋白質(zhì)同源性對比，8條序列未發(fā)現(xiàn)相似蛋白，另18條序列對比到10種相似蛋白（表5），其中1個為未知蛋白，9個分別為二氫硫辛酰胺?；D(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶、DNA導(dǎo)向的DNA聚合酶、WD重復(fù)蛋白、內(nèi)切核酸酶或糖基水解酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1、鐵硫載體集群蛋白、BnaC06g14100D蛋白和A20及AN1鋅指蛋白。在10種相似蛋白中，扭曲形云南松特有條帶序列特異地比對到7種。

表 5 不同干形云南松特有差異條帶的蛋白BLAST同源性對比Table 5 Protein homology comparison of unique different band sequences among different stem forms ofP. yunnanensis

通過在Uniprot網(wǎng)站（https://www.uniprot.org）進一步查詢相似蛋白的功能（表6），未知蛋白被亞細胞定位到線粒體，功能不詳。其余蛋白均有其特定功能，其中有5種預(yù)測蛋白為酶類，在生物體內(nèi)的多種代謝過程中充當催化劑，促進反應(yīng)的發(fā)生[9-11]。A20及AN1鋅指蛋白（SAP6基因），在動物免疫和植物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能通過影響一些相同內(nèi)源基因的表達，由一條共同的信號途徑來增強植株對水分缺乏和鹽脅迫的耐受性，此外，還在調(diào)節(jié)細胞伸長、赤霉素應(yīng)答方面發(fā)揮著作用[12-15]。WD重復(fù)蛋白能正向調(diào)節(jié)TOR（雷帕霉素靶蛋白）信號[16-17]，而TOR是一種古老基因，幾乎存在所有動植物細胞中，在調(diào)節(jié)細胞存活和凋亡過程中起關(guān)鍵性作用[18]。

表 6 相似蛋白質(zhì)的功能Table 6 Functions of homological proteins

3 結(jié)論與討論

云南松作為云南省山地造林的先鋒樹種，在云南省經(jīng)濟建設(shè)、社會發(fā)展、水土資源保護和環(huán)境地改善等方面起到了舉足輕重的作用，具有其他樹種不能比擬的適應(yīng)力和生存力[2]。然而，由于人為伐優(yōu)留劣等活動的干擾，加之環(huán)境條件惡劣，導(dǎo)致云南松林分嚴重衰退，地盤松和干形扭曲且生長矮小的“小老頭”個體越來越多，直接影響到樹干出材率，木材加工利用及木制品質(zhì)量，個別林分甚至形成扭曲形云南松純林，幾乎全部不能作為經(jīng)濟用材，嚴重制約了云南省生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益的發(fā)揮[1,19-20]。

林木干形的生長發(fā)育與其分布區(qū)生態(tài)環(huán)境條件關(guān)系密切，干形的多樣性不僅反應(yīng)了林木對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性，同時也是林木進化過程中的必然產(chǎn)物[21]。McKinney和Sando[22]報道了在短日照低光強控制下小麥葉軸的扭曲，由此提出光照差異對林木干形扭轉(zhuǎn)的影響。在瑞士和巴伐利亞海拔100～1 200 m地區(qū)生長的歐洲山毛櫸（Fagus sylvatica），干形幾乎沒有扭曲現(xiàn)象發(fā)生[23]，而對斐濟主要人工林地區(qū)的加勒比松（P.caribaea）木材特性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，海拔高地區(qū)比低洼地區(qū)扭轉(zhuǎn)程度更小[24]。但也有一些案例表明，高海拔地區(qū)趨向于形成更極端的樹干扭轉(zhuǎn)林木，認為林木干形扭轉(zhuǎn)的樹體更能適應(yīng)惡劣的環(huán)境，因此在生存、繁殖及更新上更具有優(yōu)勢[25-26]。陳守常和呂以強[27]對云南松干形扭轉(zhuǎn)現(xiàn)象進行考察并對樹干扭轉(zhuǎn)的成因進行了分析，認為云南松樹干扭轉(zhuǎn)是該樹種所具有的一種特性，林分條件（疏密度、年齡、土壤、水分），尤其疏密度則是決定樹干扭轉(zhuǎn)發(fā)生和發(fā)展的基本因素，而風(fēng)在一定情況下是促進和強化樹干扭轉(zhuǎn)的外在因子。姜漢僑[28]結(jié)合云南松分布特點和地史變遷分析認為，樹干扭曲是云南松固有性狀，即具有可遺傳性，并認為云南松樹干扭曲度變化是連續(xù)的，是一種數(shù)量性狀。何富強[29]以云南松優(yōu)樹種子、優(yōu)樹所在林分普通混合種子、商業(yè)調(diào)撥種

子和干形扭曲樹體種子作育苗栽培試驗，經(jīng)過11年的觀察和分析研究，認為云南松干形受遺傳控制，樹干的扭紋和直紋是一對相對性狀，由一對等位基因所控制。此外，云南松是雌雄同株風(fēng)媒傳粉的異花授粉植物，種子具翅，可以靠風(fēng)進行大范圍的傳播擴散，當直干形和扭曲形云南松種子通過風(fēng)的傳播落入同一片林分時，就極有可能出現(xiàn)直干形和扭曲形植株共存的現(xiàn)象[30-31]。但至今對調(diào)控云南松干形變異的功能基因知之甚少。

分子標記是研究種質(zhì)資源遺傳完整性的一種科學(xué)高效的實用技術(shù)，具有檢測位點多、結(jié)果真實可靠、不受環(huán)境影響等優(yōu)點[32]。在眾多分子標記中，SRAP標記的上、下游引物分別對基因外顯子和內(nèi)含子及啟動子區(qū)域特異性錨定，從而實現(xiàn)對功能基因開放閱讀框ORFs（Open reading frames）的擴增，由于內(nèi)含子、啟動子與間隔長度存在差異，使SRAP標記產(chǎn)生多態(tài)性[33]。由此可見，SRAP標記的多態(tài)性條帶反映了不同樣本間在相關(guān)功能基因結(jié)構(gòu)上的差異。本研究采用SRAP標記對云南松6個居群180份樣本的遺傳變異進行了分析，揭示出云南松具有較高的遺傳多樣性水平，而遺傳變異主要來源于不同個體，居群間的遺傳差異較小。該研究結(jié)果與采用SSR標記[34]、AFLP標記[35]及SNP標記[36]對云南松遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致。由于云南松遺傳變異不存在明顯的地理隔離現(xiàn)象，而氣候、地理和環(huán)境因素的影響更為顯著[37-38]，從而使得云南松不同群體的聚類關(guān)系與地理分布不一致。

現(xiàn)有云南松林分中存在著廣泛而豐富的干形扭曲變異現(xiàn)象，但其成因尚存在爭議。周安佩等[35]采用AFLP標記對直干形和扭曲形云南松的遺傳變異進行了分析，結(jié)果表明，不同干形云南松的遺傳多樣性水平與干形無明顯的相關(guān)性。鄧麗麗等[39-40]基于針葉性狀和SSR標記對云南松不同莖干類型遺傳變異分析也得到了相同的結(jié)論，云南松干形通直類型群體和干形扭曲類型群體間的遺傳多樣性存在差異，但多樣性差異不大。本研究采用SRAP標記對直干形和扭曲形云南松的遺傳差異分析結(jié)果顯示，2種干形類型間遺傳分化系數(shù)（Gst）僅為0.008 7，基因流（Nm）高達56.700 2，表明扭曲形和直干形云南松之間的基因交流頻繁，沒有發(fā)生明顯的遺傳分化，與上述研究結(jié)果一致。

與其他分子標記相比較，SRAP標記的最大特點是PCR擴增區(qū)域為功能基因開放閱讀框（ORFs），擴增得到的多態(tài)性條帶，直接體現(xiàn)了ORFs的多態(tài)性，進而體現(xiàn)出物種性狀的差異[41]。本研究對直干形和扭曲型云南松中出現(xiàn)的特異多態(tài)性條帶進行了回收、測序及序列比對，共比對到10個相似基因和10種相似蛋白，其中有7種相似蛋白特異性地與扭曲形云南松的SRAP多態(tài)性條帶序列同源。而這些相似蛋白是否參與調(diào)控云南松干形扭曲性狀的形成，還有待于進一步開展驗證。育 種 策 略 剖 析 [J].西 部 林 業(yè) 科 學(xué),2010,39(2):104?110.