譚大聰 肖坤敏 孔德仙 馬佳鈺 郭 磊 王軍民 華 燕

（西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650233）

西南遠(yuǎn)志（Polygala crotalarioides），遠(yuǎn)志科（Polygalaceae）遠(yuǎn)志屬（Polygala）多年生草本植物，主要分布于我國云南、四川、西藏等地區(qū)[1]。西南遠(yuǎn)志以根入藥，用于活血止痛、補(bǔ)心安神、心悸、失眠多夢、虛癆氣弱等[2]。西南遠(yuǎn)志在云南佤族民間用藥中被稱作“娘母良”，主要用于治療食欲不振、心悸以及增強(qiáng)體質(zhì)、強(qiáng)健筋骨等[3]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，西南遠(yuǎn)志具有抗疲勞、抗低溫、抗缺氧、提高機(jī)體應(yīng)激能力，提高機(jī)體對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力的功效[4]。黃嘌呤氧化酶是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸過程中的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是治療痛風(fēng)時(shí)藥物的作用靶點(diǎn)，徐華松等[5]，Hua等[6]，蘆毅等[7]從西南遠(yuǎn)志分離得到了1,2,3,7?四甲氧基酮等化合物，Zhu等[8]的研究表明，1,3,6,7?四羥基酮和格里菲帕維酮2個(gè)化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性的半抑制濃度（IC50）分 別 為1.2 μmol/L和6.3 μmol/L，和 別 嘌 呤 醇（IC50=5.3 μmol/L）的活性相當(dāng)，表明西南遠(yuǎn)志中的酮類化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶具有較強(qiáng)抑制活性的能力，對(duì)治療痛風(fēng)具有較好的療效。目前臨床上治療痛風(fēng)的藥物只有別嘌呤醇[9]和非布司他[10]。但它們有各自不同的副作用，如別嘌呤醇會(huì)引起皮疹、過敏反應(yīng)和腎病等[11]；非布司他最常見的副作用為肝功能異常、惡心、皮疹、關(guān)節(jié)痛等[12-13]。中藥治療痛風(fēng)已有幾千年的歷史，從中藥中尋找高效低毒的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有很大優(yōu)勢及良好前景[14]。西南遠(yuǎn)志為偶見種，已經(jīng)瀕臨滅絕，目前對(duì)其酮類化合物的相關(guān)研究鮮有研究。本研究通過紫外分光光度法原理測試西南遠(yuǎn)志中總酮的體外黃嘌呤氧化酶抑制活性和抗氧化活性，采用96孔板法測定其對(duì)金黃色葡萄球菌等5種細(xì)菌的抑制活性，利用生長速率法測定其對(duì)采絨革蓋菌等5種真菌的抑制活性，以期闡明酮類化合物抑制黃嘌呤氧化酶活性、抗氧化和抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為抗痛風(fēng)藥物研制和西南遠(yuǎn)志的綜合利用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

Evolution 300紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher，美國）；DHG?9030A型不銹鋼高溫干燥箱（河南馬弗爐技術(shù)開發(fā)有限公司，中國）；Heidolph Digital旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 儀（Heidolph Group，德 國）；BK?300GDE超聲波清洗器（陜西凱德力環(huán)?？萍加邢薰?，中國）；恒溫培養(yǎng)箱（鄭州安晟科學(xué)儀器有限公司，中國）；LDZX?50KBS立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，中國）；食品級(jí)AB?8大孔吸附樹脂、無水乙醇（上海源葉生物科技有限公司，中國）等；西南遠(yuǎn)志采自云南省云縣，由西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院杜凡教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物西南遠(yuǎn)志，標(biāo)本保存在西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院植物資源利用系藥用植物教研室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

稱取干燥后的西南遠(yuǎn)志粉末10.0 g，在60 ℃條件下，用65%乙醇，按料液比1g∶30mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏。以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法[15]測定浸膏中的總酮含量，浸膏中總酮的含量為4.45%。將浸膏用水溶解置于AB?8型大孔吸附樹脂上，用蒸餾水洗脫完全；再用30%乙醇去除皂苷類化合物；最后用90%乙醇洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮得浸膏，即為純化后的酮類化合物。純化后酮類化合物的含量為30.22%（其余成分主要為皂苷和糖脂等化合物），純化后酮類化合物的含量提高了6.79倍。總酮含

量為其質(zhì)量與浸膏質(zhì)量之比。

1.2.2 黃嘌呤氧化酶抑制活性測定

參考Masuda等[16]、李英等[17]測定方法，精密稱取1.083 8 g KH2PO4，7.315 5 g K2HPO4，加入超純水定容至250 mL，即得pH=7.5的磷酸緩沖溶液（PBS）；精密稱取18.25 mg的黃嘌呤，加入25 mL 0.05 mol/L的NaOH溶液，充分溶解后，然后加入PBS溶液定容至250 mL；取一定量的黃嘌呤氧化酶溶液，用PBS溶液配制得0.08 U/mL的黃嘌呤氧化酶工作溶液；精密稱取適量樣品，然后加PBS溶液配制成1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25 mg/mL等不同濃度，低溫避光保存，待用。將樣品及空白溶液（空白為PBS）4 mL，酶溶液2 mL（終濃度0.02 U/mL）于試管中，在37 ℃的水浴鍋上孵育3 min，再加入2 mL底物（終濃度0.12 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，在紫外分光光度計(jì)動(dòng)力學(xué)模式下291 nm波長處每隔30 s讀數(shù)1次，共計(jì)5 min，每組平行測定3次。取3次的平均值，按公式（1）計(jì)算抑制率，經(jīng)非線性回歸方法計(jì)算得乙醇粗提物和純化后總酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的IC50。

式中：(dA/dt)空白為空白組的反應(yīng)速率，(dA/dt)樣品為樣品組的反應(yīng)速率，dA/dt的時(shí)間段選擇在30～270 s。

1.2.3 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力的測定參照孫惠芳等[18]、Kaur 等[19]的方法；ABTS自由基清除能力的測定參照韓銳等[20]、Sun等[21]的方法測定；超氧陰離子自由基（O2·?）清除能力的測定參照譚曉虹等[22]的方法；羥自由基（·OH?）清除能力的測定參照韋玉蘭等[23]的方法。

1.2.4 細(xì)菌抑制活性的測定

采用96孔板法測定其最低抑菌濃度（MIC）[24]。在96孔板中，第1～10孔加供試樣品，第11孔加空白對(duì)照，第12孔加陽性對(duì)照，在1～12孔中都加入100 μL液體培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組利用二倍稀釋法加入50 μL濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL的樣品，第1～10孔的最終濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1、0.019 5、0.009 8 mg/mL，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔做平行對(duì)照，空白對(duì)照加入50 μL無菌水，陽性對(duì)照組加入0.1 g /L的鏈霉素溶液50 μL。每孔中加入50 μL菌液，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，加入0.2 g /L的碘硝基四唑紫40 μL，以是否出現(xiàn)紫色來檢查有無細(xì)菌生長，以不出現(xiàn)紫色的微孔濃度為最低抑菌濃度[25-26]，所有操作均在無菌條件下操作。

1.2.5 真菌抑制活性的測定

生長速率法[27]：采用二倍稀釋法配制成濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg /mL的樣品溶液，121 ℃滅菌22 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中分裝至無菌培養(yǎng)皿（9 cm直徑）中。溶劑對(duì)照采用不加樣品的無菌水，空白對(duì)照為不加任何樣品和溶液的PDA培養(yǎng)基。用滅菌后的5 mm打孔器在已活化好的病原真菌菌落上打取菌餅，在每個(gè)培養(yǎng)皿中心位置放1個(gè)菌餅，然后標(biāo)記后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，觀測記錄，所有病原真菌應(yīng)在同一天內(nèi)接種完畢。按公式（2）[28]計(jì)算抑菌率（IR），經(jīng)非線性回歸方法計(jì)算得各菌的半抑制濃度（EC50）。

式中：D0為空白對(duì)照凈直徑，Ds為處理組凈直徑，Dn為溶劑對(duì)照凈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 西南遠(yuǎn)志乙醇粗提物和純化后總酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性

圖 1 西南遠(yuǎn)志乙醇粗提物和純化后總酮對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of the crude ethanol extract and the xanthone compounds after purification from P. crotalarioidesagainst xanthine oxidase

2.2 西南遠(yuǎn)志乙醇粗提物和純化后總酮對(duì)4種自由基的抑制活性

7.33 μg/mL。

圖 2 西南遠(yuǎn)志乙醇粗提物和純化后總酮對(duì)4種自由基的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of the crude ethanol extract and the xanthone compounds after purification fromP. crotalarioidesagainst 4 radicals

2.3 西南遠(yuǎn)志純化后的總酮對(duì)5種細(xì)菌的抑制活性

5 mg/mL。

表 1 純化后酮類化合物對(duì)不同食源性致病菌的MICTable 1 The MIC of purified xanthone compounds against different food-borne pathogens mg/mL

表 1 純化后酮類化合物對(duì)不同食源性致病菌的MICTable 1 The MIC of purified xanthone compounds against different food-borne pathogens mg/mL

注：“-”表示無菌生長；“+”表示菌生長較弱；“++”表示菌生長較強(qiáng)；“+++”表示菌生長強(qiáng)。

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2.4 西南遠(yuǎn)志純化后的總酮對(duì)5種真菌的抑制活性

由表2可知，在5種真菌中，對(duì)采絨革蓋菌（Coriolus versicolor）具有最強(qiáng)的抑菌效果，其EC50值 為0.237 9 mg/mL，其 次 為 蕓 苔 鏈 格 孢（Alternaria brassicicola）、腐皮鐮孢（Fusariumsolani）、尖孢鐮孢（Fusarium oxysporum），其EC50值分別為0.368 7、0.507 4、0.899 1 mg/mL，對(duì)禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）的抑菌能力最弱，其EC50值為1.184 4 mg/mL。由圖3可知，在低濃度時(shí)對(duì)腐皮鐮孢的抑制活性最好，高濃度時(shí)對(duì)蕓苔鏈格孢的抑制活性最好。

表 2 純化后酮類化合物對(duì)五種真菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

表 2 純化后酮類化合物對(duì)五種真菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

菌種 毒力回歸方程R2EC50/(mg·mL?1)腐皮鐮孢y=0.2104x+0.394 5 0.968 6 0.507 4禾谷鐮孢y=0.246 7x+0.207 8 0.960 3 1.184 4尖孢鐮孢y=0.404 3x+0.136 5 0.985 1 0.899 1蕓苔鏈格孢y=0.772 8x+0.215 1 0.957 9 0.368 7采絨革蓋菌y=0.442 6x+0.394 7 0.989 9 0.237 9

圖 3 純化后酮類化合物對(duì)5種真菌的抑制活性Fig.3 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

3 結(jié)論與討論

黃嘌呤氧化酶是體內(nèi)核酸代謝中重要的酶，能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化生成尿酸，同時(shí)產(chǎn)生過氧化物自由基，尿酸濃度過高將導(dǎo)致高尿酸血癥，可引起痛風(fēng)發(fā)作，自由基涉及到炎癥等一系列病理過程，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，既可以減少體內(nèi)尿酸的形成，有效地阻止或延緩?fù)达L(fēng)及其并發(fā)癥，又可以減少自由基造成的組織傷害[29]；試驗(yàn)研究表明，西南遠(yuǎn)志中的酮類化合物具有良好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，作為黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過阻斷次黃嘌呤到黃嘌呤，從黃嘌呤到尿酸的轉(zhuǎn)化來降低血尿酸水平，達(dá)到預(yù)防和治療痛風(fēng)的效果，為云南豐富的遠(yuǎn)志屬植物資源的進(jìn)一步高效合理利用提供科學(xué)依據(jù)。