候建平 鄭思思 龍 鑫 海佳怡 王 穩(wěn)* 朱麗琳

(1.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，西寧，810016；2.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，西寧，810016；3.西寧市野生動物疫源疫病監(jiān)測站，西寧，810001)

全球鷲類僅有23種，中國有8種(占34.8%)，是世界上鷲類資源較為豐富的國家之一[1]。早在2015—2016年，中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所馬鳴研究員曾提出拯救“三鷲”之倡議，建議在中國重點保護禿鷲(Aegypiusmonachus)、胡兀鷲(Gypaetusbarbatus)和高山兀鷲(Gypshimalayensis)3種鷲類，目的是以此“三鷲”的保護與科研為典范，發(fā)揮示范帶動效應，進而推動我國分布的8種鷲類的全面保護。高山兀鷲，又名喜馬拉雅兀鷲，在動物分類上，隸屬于鷹形目(Accipitriformes)，鷹科(Accipitridae)[2]。在保護等級上，高山兀鷲為國家二級保護鳥類，受到法律保護。也被列入瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES公約)附錄Ⅱ，限制貿(mào)易。世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)在2014年將其列入瀕危物種紅色名錄，保護等級為近危(Near Threatened，NT)[3]。在種群數(shù)量上，國際鳥類聯(lián)盟(BirdLife International)給出的高山兀鷲全球種群數(shù)量預估數(shù)字為66 000—334 000[3]。我國鳥類學者盧欣教授則估計高山兀鷲的全球種群數(shù)量約為286 749(±50 559)只，同時估計了我國青藏高原的種群數(shù)量為229 339(±40 447)只，最大容納量可達507 996只[4]。在地理分布上，高山兀鷲集中分布于我國的西部高山、高原地區(qū)，包括天山、昆侖山、帕米爾高原、喀喇昆侖山、喜馬拉雅山以及青藏高原。國外主要分布于中亞、印度等地。從食物鏈的角度而言，高山兀鷲以腐為食，享有“自然界清道夫”的美譽，是食物鏈中不可或缺的一環(huán)。由于諸多威脅因素的存在，高山兀鷲野外種群數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢[5]。目前高山兀鷲全球種群受威脅因素包括：食物缺乏、棲息地破壞、環(huán)境污染、盜獵與販賣、標本制作、電網(wǎng)威脅以及獸藥濫用(如雙氯芬酸類藥物)[6]等。關于高山兀鷲的研究內容多集中在：高山兀鷲的種群分布與記錄[5，7]，高山兀鷲死亡樣本的形態(tài)學與組織學研究[8-9]，高山兀鷲繁殖生態(tài)學的研究[10-12]以及國外研究者開展的雙氯芬酸類獸藥影響高山兀鷲生理及種群數(shù)量的研究[13-15]。

隨著高通量測序技術以及生物信息分析手段的巨大進步，腸道微生物組學(gut microbiome)成為當下生命科學的研究熱點。越來越多的研究表明，寄生、互利共生、共棲于腸道的微生物與宿主的神經(jīng)系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)存在相互調控，進而與宿主的生理(發(fā)育、免疫穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)物質代謝及維生素合成等)及眾多疾病的發(fā)生存在關聯(lián)，甚至影響著宿主的情緒及行為[16]。對于野生鳥類而言，腸道微生物從羽毛護理到卵的孵化等多個層面影響著鳥類宿主的生理及病理過程[17-20]。結合本課題組近年來開展的野生鳥類腸道微生物組學研究，我們提出觀點，高山兀鷲的腸道微生物必然是“取之于腐食，用之于腐食”。所謂“取之于腐食”，即腐食中存在的各種微生物會被高山兀鷲攝取，然后定殖于其腸道區(qū)域，成為其腸道微生物組的一部分。所謂“用之于腐食”，即經(jīng)過漫長的進化，受到自然選擇并被保留下來的與高山兀鷲宿主達到互利共生狀態(tài)的腸道微生物組，既可輔助高山兀鷲對腐食進行消化、吸收及代謝；又可輔助高山兀鷲抵抗腐食中出現(xiàn)的病原菌。因此，從腸道微生物的角度闡釋高山兀鷲腐食適應機制是一個值得深入探索的研究領域。近年來，國內只有中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所徐建國院士課題組利用宏分類組學的方法分析了高山兀鷲、禿鷲以及胡兀鷲的腸道微生物譜系，并利用培養(yǎng)的方法得到了高山兀鷲腸道放線菌屬(Actinomyces)的新種[21-22]。而國外對鷲類腸道微生物組的研究多集中于紅頭美洲鷲(Cathartesaura)和黑頭美洲鷲(Coragypsatratus)[23-25]，關于高山兀鷲腸道微生物組的研究尚未見國外報道。本課題組在國家自然科學基金以及青海省自然科學基金的資助下，解析高山兀鷲腸道微生物組結構，探究高山兀鷲腸道微生物組功能，挖掘高山兀鷲腸道益生菌種資源，以期為高山兀鷲腐食適應性機制研究增添腸道微生物組學層面的新內容。本研究對高山兀鷲新鮮糞便中的微生物進行分離與鑒定，并對獲得的菌種進行耐藥性檢測，這可為進一步研究高山兀鷲腸道微生物的耐藥機制提供依據(jù)，有助于增添對高山兀鷲生理生態(tài)的新認知。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

本研究在青海省海南藏族自治州興海縣境內(99.922 15°E，35.835 51°N，海拔3 751 m)采集到野生高山兀鷲新鮮糞便。將采集的新鮮糞便樣本放入車載冰箱中運回實驗室立即處理。

1.1.2 主要儀器

SW-CJ-1FD無菌超凈臺、Whitley A35厭氧培養(yǎng)工作站、KG-SX-500高壓滅菌鍋、NRY-2102C恒溫培養(yǎng)箱與搖床、ProFlex PCR儀。

1.1.3 主要試劑和培養(yǎng)基

細菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix以及DL2000 marker(均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司)。LB瓊脂、LB肉湯、MRS瓊脂以及MRS肉湯(均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司)。

1.1.4 藥敏紙片

本研究共使用34種藥敏紙片(均購自上海源葉生物科技有限公司)。藥敏紙片上分別含有抗生素四環(huán)素、復方新諾明、氧氟沙星、新霉素、多粘菌素B、頭孢拉定、拉氧頭孢鈉、苯唑西林、氨曲南、哌拉西林、厄他培南、制霉菌素、諾氟沙星、紅霉素、氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢呋辛、丁胺卡那、環(huán)丙氟哌酸、甲氧芐胺嘧啶、克拉霉素、頭孢他啶、左氧氟沙星、吉他霉素、頭孢曲松、阿莫西林、強力霉素、林可霉素、克林霉素、妥布霉素、阿奇霉素、青霉素G和鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與純化

在無菌條件下，將高山兀鷲糞便樣本，放入1 mL無菌水中，3 000 r/min離心5 min。取懸液100 μL，在無菌水中進行10倍梯度稀釋，制成10-1至10-9梯度稀釋液。分別吸取其中的10-1，10-3，10-5，10-7，10-9稀釋液涂布在LB瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基上。分別在有氧以及厭氧培養(yǎng)工作站中，37℃培養(yǎng)24—48 h。然后挑取表征(顏色、大小、形狀)不同的單菌落于LB肉湯和MRS肉湯中，分別在有氧以及厭氧培養(yǎng)工作站中37℃培養(yǎng)12 h。再將相應LB肉湯和MRS肉湯中的菌液涂布至LB瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基中，分別在有氧以及厭氧培養(yǎng)工作站中進行第二輪純化培養(yǎng)。如此反復，經(jīng)過5輪純化培養(yǎng)后，最終獲取LB瓊脂和MRS瓊脂中能夠在有氧以及無氧條件下生長的純化的單菌落。

1.2.2 16S rRNA基因的擴增與鑒定

按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟，提取上述純化后的細菌總DNA，利用細菌的16S rRNA基因常用的擴增引物對(上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)進行PCR擴增。PCR反應體系為：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 21 μL，總體積50 μL。PCR反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)35次；72℃ 10 min。4℃保存。陽性對照，用實驗室保存的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)菌株的DNA作為模板；陰性對照，用dd H2O作為模板。分別取7 μL上述PCR產(chǎn)物和DL2000 marker，用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，若檢測結果中出現(xiàn)約1 500 bp的條帶則為陽性。將上述PCR擴增陽性的產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

將測序結果利用NCBI的BLAST程序進行序列相似性比對，找到同源性最高的序列，進而確定細菌的分類水平。然后，利用歐洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)在線提供的多重序列比對工具Clustal Omega(https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，對每個種包含的多條測序序列進行多重序列比對，目的是剔除掉具有相同序列的測序結果。在此基礎上，再將每一種細菌經(jīng)多重序列比對后的最長序列作為代表性序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫。同屬細菌16S rRNA基因的相似性為97%—99%；相似性小于97%的為潛在新菌種；同種不同株的相似性大于99%[26]。運用MEGA X軟件[27]，以maximum composite likelihood模型計算遺傳距離，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)對測序獲得的16S rRNA基因序列構建系統(tǒng)進化樹[28]，Bootstrap自展1 000次檢驗進化樹拓撲結構置信區(qū)間，以痰液彎曲菌(Campylobactersputorumstrain ATCC 33709)為外類群。

1.2.3 生化鑒定

挑取純培養(yǎng)的單菌落到生理鹽水管中，調節(jié)麥氏度為0.5，吸取0.5 mL菌液接種于細菌生理生化鑒定管(杭州微生物試劑有限公司)中，放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24—38 h，判定結果。判定依據(jù)為《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[29]。

1.2.4 藥敏試驗

采用藥敏紙片瓊脂擴散法(K-B法)，將麥氏度為0.5的菌液均勻涂在瓊脂培養(yǎng)基上，貼上34種藥敏紙片，每一種類的藥敏紙片貼3片作為重復。將貼有藥敏紙片的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16 h后測量抑菌圈直徑，并依據(jù)抗菌藥物敏感性試驗的技術要求(WS/T 639-2018)判定結果[30-31]。以大腸埃希氏菌ATCC25922為質控菌株，若質控菌株的藥物敏感度正常，則藥敏試驗的結果可靠。

2 結果

2.1 細菌分離與純化

分別利用LB和MRS培養(yǎng)基，在有氧以及厭氧條件下，對高山兀鷲糞便樣本中的微生物進行分離與純化。經(jīng)過5輪純化后，根據(jù)單克隆形狀、顏色和大小的不同，最終挑選119個單克隆。其中包括：MRS培養(yǎng)基(有氧條件)挑選42個單克隆，MRS培養(yǎng)基(無氧條件)挑選15個單克隆，LB培養(yǎng)基(有氧條件)挑選30個單克隆，LB培養(yǎng)基(無氧條件)挑選32個單克隆。

2.2 16S rRNA鑒定結果

對上述119個單克隆菌株提取基因組DNA，PCR擴增16S rRNA基因后，用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。所有擴增產(chǎn)物均檢測到電泳條帶，且大小在1 500 bp左右，與預期大小相符，可用于后續(xù)的一代測序。所有119個單克隆菌株的16S rRNA基因測序全部成功。將所有測序結果利用NCBI的BLAST程序進行序列相似性比對，發(fā)現(xiàn)119個單克隆菌株隸屬于6個屬、8個種，分別是大腸埃希氏菌、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、奧斯陸莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、索氏類梭菌(Paeniclostridiumsordellii，以前稱為Clostridiumsordellii)以及腸球菌屬(Enterococcus)的3個種，蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)、海氏腸球菌(Enterococcushirae)與耐久腸球菌(Enterococcusdurans)。上述每一個種僅將最長的序列作為代表序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號。上述8種細菌的登錄號分別為MT740347、MT740350、MT740351、MT740352、MT740353、MT740354、MT740355、MT7 40378。最后，用上述8個種的最長序列構建系統(tǒng)進化樹(圖1)。

2.3 分離菌的生化鑒定

對上述分離到的8種細菌進行生化鑒定，生化鑒定結果見表1。表1中的8種細菌的生化鑒定結果與各自16S rRNA鑒定結果保持一致。

表1 分離菌株生化鑒定結果

續(xù)表1

2.4 分離菌的藥敏試驗

對上述8個種的代表性菌株進行34種抗生素的藥敏試驗。結果顯示(表2)：大腸埃希氏菌對頭孢拉定、苯唑西林、制霉菌素、紅霉素、吉他霉素、阿莫西林、林可霉素、克林霉素以及青霉素G耐藥。藤黃微球菌對復方新諾明、苯唑西林、氨曲南、制霉菌素、氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢呋辛、甲氧芐胺嘧啶、頭孢曲松、阿莫西林、林可霉素以及青霉素G耐藥。奧斯陸莫拉氏菌對復方新諾明、苯唑西林、制霉菌素、甲氧芐胺嘧啶、頭孢曲松、阿莫西林、林可霉素以及克林霉素耐藥。蠟樣芽孢桿菌對復方新諾明、多粘菌素B、苯唑西林、氨曲南、制霉菌素、氨芐青霉素、頭孢呋辛、甲氧芐胺嘧啶、頭孢他啶、頭孢曲松、阿莫西林以及林可霉素耐藥。索氏類梭菌對復方新諾明、新霉素、制霉菌素、丁胺卡那、甲氧芐胺嘧啶、林可霉素、妥布霉素以及鏈霉素耐藥。蒙氏腸球菌對復方新諾明、新霉素、氨曲南、制霉菌素、丁胺卡那、頭孢他啶、林可霉素、克林霉素、妥布霉素以及鏈霉素耐藥。海氏腸球菌對復方新諾明、新霉素、多粘菌素B、頭孢拉定、苯唑西林、氨曲南、制霉菌素、頭孢呋辛、丁胺卡那、甲氧芐胺嘧啶、頭孢他啶、阿莫西林、林可霉素、克林霉素、妥布霉素以及鏈霉素耐藥。耐久腸球菌對四環(huán)素、復方新諾明、新霉素、多粘菌素B、頭孢拉定、拉氧頭孢鈉、苯唑西林、氨曲南、厄他培南、制霉菌素、紅霉素、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢呋辛、丁胺卡那、甲氧芐胺嘧啶、克拉霉素、頭孢他啶、吉他霉素、頭孢曲松、阿莫西林、林可霉素、克林霉素、妥布霉素、阿奇霉素以及鏈霉素耐藥。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這8種代表性菌株對8到26種不等的抗生素表現(xiàn)出耐藥性。其中，耐久腸球菌可耐受高達26種之多的抗生素。奧斯陸莫拉氏菌、索氏類梭菌以及大腸埃希氏菌可耐受的抗生素種類較少。從抗生素抑制細菌的角度進行分析，發(fā)現(xiàn)本研究中34種抗生素能夠抑制的代表性菌株的種類數(shù)量在0到8種不等。其中，氧氟沙星、哌拉西林、諾氟沙星、環(huán)丙氟哌酸、左氧氟沙星以及強力霉素能夠抑制本研究中分離到的所有8種代表性菌株。而制霉菌素以及林可霉素對所有分離到的8種代表性菌株均無抑制作用。

表2 分離菌株藥敏試驗結果

續(xù)表2

3 討論

高山兀鷲作為食腐鳥類的典型代表，其腐食適應性機制的研究一直備受關注。2014年，丹麥的Roggenbuck等[23]首次從腸道微生物組的角度對比分析了黑頭美洲鷲和紅頭美洲鷲的腸道宏基因組，進而從區(qū)別于全基因組測序的另一角度，即腸道微生物組的角度，闡釋鷲類腐食適應性機制[24-25]。目前研究認為，腸道微生物與宿主在協(xié)同進化過程中[32]，與宿主的免疫系統(tǒng)相互調控[33]。腸道微生物一方面促進免疫系統(tǒng)成熟，另一方面輔助宿主抵抗病原菌的侵襲[34]?；诖耍狙芯吭谡n題組對高山兀鷲腸道微生物組進行高通量測序(數(shù)據(jù)未發(fā)表)的基礎上，對高山兀鷲腸道微生物進行分離、培養(yǎng)與鑒定。共分離到119株細菌。進一步根據(jù)16S rRNA以及生化鑒定結果，鑒定出8種細菌，隸屬于6個屬?；诰?6S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹顯示，6個屬形成了6個大的分枝。腸球菌屬的3個種形成3個小的分枝。這些系統(tǒng)進化關系分析結果為菌株的后續(xù)研究提供了背景資料。此外，這些菌株在GenBank中獲得的序列號為菌株作了生物標記，可進一步為菌株的后續(xù)產(chǎn)權保護提供依據(jù)。8種細菌中，大腸埃希氏菌、奧斯陸莫拉氏菌以及索氏類梭菌是重要的條件致病菌。這也提示我們，高山兀鷲因為獨特的食腐習性，容易遭受到病原菌的侵襲。葉妍琳等[35]采集昆明動物園發(fā)病死亡禿鷲的心臟、肝臟病灶進行細菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)病原菌為黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和大腸埃希氏菌。作為條件致病菌，當動物體免疫力下降時，大腸埃希氏菌引發(fā)宿主出現(xiàn)嚴重腹瀉和敗血癥，是危害養(yǎng)禽業(yè)以及畜牧業(yè)的重要病原菌[36]。有研究表明奧斯陸莫拉氏菌可以導致敗血癥、腦膜炎、肺炎以及泌尿生殖系統(tǒng)感染[37]。在國內，研究人員從鴨、火雞、奶牛以及家豬等家禽家畜體內均分離到致病性奧斯陸莫拉氏菌[38]。索氏類梭菌是一種厭氧孢子生成菌，其毒力菌株可在人類中引起水腫、壞疽、低血壓和全身中毒性休克，死亡率約為70%[39-40]。這些病原菌與高山兀鷲的相處之道是什么以及這些病原菌隨高山兀鷲糞便排出體外后對環(huán)境以及環(huán)境中其他野生動物的影響，都是值得深入研究的問題。

與上述3種條件致病菌相區(qū)別的是，本研究中分離到的其余5種腸道微生物則是具有潛在益生功能的細菌。藤黃微球菌在正常機體中會被吞噬細胞的溶菌酶殺滅[41]，因此，多數(shù)不致病，少數(shù)菌株為條件致病菌[42]。此外，作為細菌型腐乳生產(chǎn)的典型代表菌株，藤黃微球菌在腐乳的生產(chǎn)加工與應用等方面發(fā)揮著重要作用[43]。有研究表明藤黃微球菌還可作為潛在益生菌用于尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的生產(chǎn)養(yǎng)殖[44]。蠟樣芽孢桿菌是國內外常用于畜禽生產(chǎn)上的益生菌之一，張嬌等[45]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌具有促進肉雞生長，增強腸道消化酶活性以及促進免疫器官發(fā)育等功效。腸球菌屬屬于乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)，目前作為益生菌的研究熱點，多種腸球菌菌株已經(jīng)被廣泛應用于各種藥物、發(fā)酵食品以及微生態(tài)制劑[46]。本研究發(fā)現(xiàn)的3種腸球菌，蒙氏腸球菌[47]、海氏腸球菌[48-49]以及耐久腸球菌[50]，分別都有益生功效的研究。這些潛在益生菌在高山兀鷲食腐食性中的作用是值得深入研究的問題。尤其是這些潛在益生菌能否發(fā)揮輔助高山兀鷲消化腐食以及抑制腐食中病原菌的功能，是未來研究的重要內容。

對本研究中分離的菌株進行藥敏試驗，結果顯示，這些菌株對8到26種不等的抗生素表現(xiàn)出耐藥性。當細菌長期處于含抗生素的生存環(huán)境時，在選擇壓力下，敏感菌株被抑制或殺滅，而天然耐藥或獲得性耐藥菌株則繼續(xù)生存、繁殖和克隆傳播，進一步導致細菌的耐藥性不斷增高[51-52]。這些存在于高山兀鷲腸道內的耐藥菌株，很可能來自腐食，尤其是家養(yǎng)動物的腐尸。青藏高原地區(qū)高山兀鷲的食物主要包括，家牦牛、藏羊、馬、驢、狗等5種家養(yǎng)動物和野牦牛(Bosgrunniens)、藏野驢(Equuskiang)、藏羚羊(Pantholopshodgsoni)等3種野生動物，以及人類尸體(來源于藏族人民傳統(tǒng)喪葬文化中的天葬)[4]。獸藥的使用可能導致家養(yǎng)動物本身的細菌產(chǎn)生耐藥性[53-54]，進一步通過腐食食物鏈傳遞給高山兀鷲等食腐動物。獸藥研制過程中，會著重考慮藥物對牲畜及人體的影響，而對以腐為食的鷲類等鳥類的影響則缺乏深入的考量與研究。尤其是在死亡家牦牛及藏羊構成高山兀鷲主要食物來源的青藏高原地區(qū)，該類研究極度缺乏。一方面，我們不清楚哪些藥物被廣泛用于青藏高原地區(qū)的畜牧業(yè)養(yǎng)殖中；另一方面，這些藥物是否已經(jīng)在家牦牛及藏羊體內形成了殘留；最后，這些藥物殘留是否已經(jīng)富集到高山兀鷲等食腐鳥類體內，最終對高山兀鷲等食腐鳥類的生理及種群狀況構成威脅。積累藥物殘留對食腐鳥類定性與定量影響的數(shù)據(jù)，進而反饋到藥物研發(fā)環(huán)節(jié)，最終實現(xiàn)藥物的生理安全與生態(tài)安全共贏，這些都是需要進行深入系統(tǒng)研究的問題。本研究選用的34種抗生素，增加了對高山兀鷲菌株耐藥性的新認識，對其保護具有重要意義。