張夢潔，周濟(jì)，潘天榮，鐘興(通信作者)

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 合肥 230601；2.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，安徽 合肥 230032）

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是一種進(jìn)展性的復(fù)雜的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致當(dāng)今成年人不可逆失明最常見的病因。至今其發(fā)病機(jī)制尚未明確，長期慢性高血糖是DR 的發(fā)病基礎(chǔ)[1]。近年來，炎癥或免疫反應(yīng)因素在DR 中的作用日益受到重視。免疫衰老對慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展起到不可或缺的推動作用，并與各種與年齡相關(guān)的代謝性疾病和免疫紊亂有關(guān)。共刺激分子受體CD 28 的缺失和CD 57 表達(dá)的增加是人類CD8+T 細(xì)胞衰老免疫系統(tǒng)的重要標(biāo)志[2,3]。據(jù)研究表明，衰老CD8+T 細(xì)胞可以產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性介質(zhì)，與高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗死等慢性炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[4]。盡管有證據(jù)表明免疫衰老會導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[5]，但沒有研究評估CD8+T細(xì)胞衰老增加是否與DR 有關(guān)。本研究旨在探討外周血衰老CD8+T 細(xì)胞頻率與DR 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018 年1 月至2019 年5 月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的127 例T2DM 患者為研究對象，其中男性69 例，女性58 例，均符合1999 年WHO 制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均行眼底檢查，根據(jù)2002 年國際眼病學(xué)會制定的DR 分級標(biāo)準(zhǔn)[6]，由眼科專科醫(yī)生根據(jù)眼底照相結(jié)果診斷患者是否為DR，并分為兩組：非DR 組(NDR 組)46 例，男25 例，女21 例，平均年齡（50.5±9.6）歲；DR 組41 例，男22例，女19 例，平均年齡（56.5±5.5）歲；同期體檢中心經(jīng)年齡和性別匹配后隨機(jī)選取健康體檢者為對照組（NC 組）40 例，男22 例，女18 例，平均年齡（51.0±5.8）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：1 型糖尿病及其他特殊類型糖尿病患者；T2DM 伴急性并發(fā)癥；肝腎功能不全及惡性腫瘤病史患者；近1 個(gè)月內(nèi)服用降脂藥物和噻唑烷二酮類藥物患者；因視盤周圍大血管不清晰及眼底檢查圖像模糊而不能確診患者；白內(nèi)障、青光眼等患者；有吸煙史及長期大量飲酒史、因各種原因無法配合檢查患者。本研究通過安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（YJYX2020-004），研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料

收集患者一般臨床資料如年齡、性別、糖尿病病程、吸煙飲酒史等；受試者清晨脫鞋、免冠，測量身高、體重、腰圍，精確度為0.01m 和0.1kg，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI）=體重（kg）/身高2（m2），休息0.5h 后平臥位測量右上肢血壓三次取其平均值。收集肝腎功能、血脂、空腹血糖、空腹胰島素、血常規(guī)等生化指標(biāo)。計(jì)算中性粒細(xì)胞／淋巴細(xì)胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）和血小板／淋巴細(xì)胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）。

1.2.2 流式細(xì)胞檢測及實(shí)驗(yàn)室檢查

采集T2DM 患者及健康對照者外周靜脈血2mL，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。取流式試管1 個(gè)，分別加入CD57-異硫磺酸熒光素（FITC）、CD28-藻紅蛋白熒光素（PE）、CD4-別藻藍(lán)蛋白（APC）、CD8-藻紅蛋白- 德克薩斯紅（ECD）、CD3-紫草素葉綠素（PerCP）、CD45-(Pacific blue) 等抗體各2ul（均購自美國BD 公司），再加入抗凝血50ul，混勻。避光溫育15min 后，加入2mL 氯化銨溶血，靜置10min 后上流式細(xì)胞儀檢測（美國Beckman Coulter 流式細(xì)胞儀）；應(yīng)用Cyto FLEX 軟件獲取并分析，計(jì)算外周血中CD3+CD8+CD57+CD28-占CD8+T 淋巴細(xì)胞比例；全自動生化檢測儀采用ELISA 檢測血清生化及其他指標(biāo)。檢測前常規(guī)對流式細(xì)胞儀進(jìn)行光流路質(zhì)量調(diào)控和熒光補(bǔ)償，使儀器各項(xiàng)指標(biāo)在質(zhì)量控制允許值范圍 。檢測時(shí)首先根據(jù)前向 (FSC)和側(cè)向(SSC)散射光信號對淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，每份標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞在10000 個(gè)以上，檢測后數(shù)據(jù)以Listmode 文件形式保存。

1.2.3 胰島β 細(xì)胞功能評估

以標(biāo)準(zhǔn)饅頭餐負(fù)荷試驗(yàn)評估胰島β 細(xì)胞功能，使用胰島素治療后空腹血糖控制在10 mmol/L 以下時(shí)行標(biāo)準(zhǔn)饅頭餐負(fù)荷試驗(yàn)。葡萄糖氧化酶法測定空腹及餐后2 小時(shí)血糖，化學(xué)發(fā)光法（羅氏診斷，瑞士）檢測空腹及餐后2 小時(shí)血清C 肽。胰島素敏感指數(shù)（homeostasis assessment insulin sensitivity ,HOMA2-ISI）、胰島β 細(xì)胞功能指數(shù)（homeostasis model assessment 2-%β，HOMA2-%β）和胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA2-IR）使用HOMA2 軟件計(jì)算，軟件下載網(wǎng)址為http://www.dtu.ox.ac.uk。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料組間采用卡方檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)（上下四分位數(shù)）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。Spearman 相關(guān)分析衰老T 細(xì)胞水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。Logistic 回歸分析T2DM 合并DR 的影響因素。以P＜0.01 或P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床指標(biāo)及外周血各類T 細(xì)胞水平比較

DR 組及NDR 組空腹血糖水平均顯著高于NC 組（均P＜0.05）。同時(shí)兩組HDL-C 均顯著低于NC 組（均P＜0.05）。DR 組年齡、TG、LC 及SCr 均顯著高于NDR 組及NC 組（均P＜0.05）。DR 組病程、HOMA-IS、HOMA-IR、CP、NLR 及PLR 均顯著高于NDR 組（均P＜0.05）。三組間性別卡方檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HbA1c、LDL、BMI、TC 等非參數(shù)檢驗(yàn)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05，見表1）。

DR 組及NDR 組外周血CD3+T 細(xì)胞水平均顯著高于NC組（均P＜0.05）。DR 組衰老CD8+T 細(xì)胞和衰老CD3+CD8+ T細(xì)胞水平均顯著高于NDR 組及NC 組（均P＜0.05）。但兩組間衰老CD4+T 細(xì)胞和衰老CD3+CD4+T 細(xì)胞水平非參數(shù)檢驗(yàn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表2）。CD3+CD8+T 細(xì)胞水平三組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（見表2）

2.2 Spearman 相關(guān)分析

外周血CD8+衰老T 細(xì)胞與DR、HOMA2-IR、FPG、FCP呈正相關(guān)(r=0.325、0.286、0.246、0.228，均P＜0.05)，與胰島素敏感指數(shù)（HOMA2-ISI）呈負(fù)相關(guān)（r=-0.264，P＜0.05，表3 ）。

2.3 Logistic 回歸分析

為排除混雜因素影響，將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量引入非條件多因素Logistic 回歸分析模型，以有無DR 為因變量，以SCr、HOMA2-β、NLR、PLR、FPG、BMI、LDL-C、HDL-C 等指標(biāo)為自變量，把性別、年齡和病程三個(gè)作為協(xié)變量進(jìn)入模型，調(diào)整上述三個(gè)變量，一定程度上校正了不均衡性。結(jié)果顯示TG、HOMA2-IR、PLR 和衰老CD8+T 細(xì)胞是DR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=2.080、2.297、1.030、1.074，均P＜0.05，表4）。

3 討論

DR 是糖尿病患者一種嚴(yán)重的微血管眼底病變，是導(dǎo)致糖尿病患者失明的首要原因。大多患者視力損害呈漸進(jìn)性加重，引起視覺損傷時(shí)才引起重視，從而錯失了治療的最佳時(shí)機(jī)，導(dǎo)致不可逆性失明，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量[7]。因此，早期識別 DR的危險(xiǎn)因素，及時(shí)干預(yù)病情進(jìn)展，對改善臨床癥狀意義重大。

目前研究發(fā)現(xiàn)衰老CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了一些慢性低度炎癥疾病的病理生理過程[4]。糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，其特征是胰島素抵抗引起的葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，并伴有慢性低度全身炎癥[8]。動物實(shí)驗(yàn)[5]及人體研究[9]結(jié)果均表明，外周血中衰老的CD8+T 細(xì)胞頻率增加與2 型糖尿病的患病率和獨(dú)立相關(guān)，其原因可能是：（1）糖尿病患者衰老T 細(xì)胞通過高表達(dá)促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞毒分子介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)，參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展；（2）衰老T 細(xì)胞損傷肝臟的胰島素敏感性，使糖調(diào)節(jié)受損。本研究結(jié)果顯示，T2DM 患者外周血衰老CD8+T 細(xì)胞頻率較正常對照組明顯增加，并且衰老CD8+T 細(xì)胞與FPG、HOMA2-IR 呈正相關(guān)，與HOMA2-ISI 呈正相關(guān)，這與上述研究結(jié)果相似。

DR 是糖尿病微血管并發(fā)癥在視網(wǎng)膜血管的表現(xiàn)，主要危險(xiǎn)因素包括糖尿病病程延長、血糖控制不佳、血脂異常、IR、炎癥反應(yīng)、PLR 等[10]。IR 是指機(jī)體對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取和利用能力下降，表現(xiàn)為靶組織細(xì)胞對胰島素的不敏感，是T2DM 發(fā)病的重要機(jī)制。臨床研究發(fā)現(xiàn)IR 是 T2DM 患者發(fā)生 DR 的一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。本研究顯示衰老CD8+T 細(xì)胞水平升高是DR 的危險(xiǎn)因素，衰老CD8+T 細(xì)胞可能參與了DR的發(fā)生和進(jìn)展，但其確切機(jī)制尚不清楚，可能主要包括：（1）IR 是DR 發(fā)病的危險(xiǎn)因素，既往研究表明[11]，促炎細(xì)胞因子可以促進(jìn)胰島素抵抗，衰老CD8+T 細(xì)胞通過分泌更多的炎性因子和細(xì)胞毒性分子，損害肝臟胰島素敏感性，促進(jìn)胰島素抵抗，從而加重DR 的損傷；（2）有研究發(fā)現(xiàn)[12]，DR 患者的氧化應(yīng)激水平高于無DR 糖尿病患者和正常對照組。提示氧化應(yīng)激是DR 進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因子。衰老CD8+T 細(xì)胞存在著線粒體功能障礙，特征是線粒體含量減少，剩余的線粒體積增大伴功能失調(diào)，從而導(dǎo)致活性氧(ROS)生成增加，進(jìn)一步激活視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重IR；（3）有學(xué)者指出[13]腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）參與DR 的發(fā)生和進(jìn)展，血清TNF-α 水平升高與DR 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，衰老CD8+T 細(xì)胞可分泌高水平的TNF-α，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管通透性增高，刺激血管外基質(zhì)過量產(chǎn)生和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致眼內(nèi)新生血管形成，促進(jìn)DR 進(jìn)展；（4）長期血糖控制不佳是 DR發(fā)病的基礎(chǔ)和危險(xiǎn)因素，衰老CD8+T 細(xì)胞可能參與糖尿病發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)，引起糖穩(wěn)態(tài)失衡[14]。（5）有學(xué)者指出[15]PLR 是一種與DR 的發(fā)生密切相關(guān)的新型炎癥指標(biāo)，代表感染和免疫信號，而DR 患者體內(nèi)衰老T 細(xì)胞的增加可引起T細(xì)胞功能障礙[16]，對免疫功能產(chǎn)生負(fù)面影響并加重感染，從而導(dǎo)致了DR 患病率的升高。上述研究證實(shí) IR、炎癥反應(yīng)和慢性高血糖共同參與了DR 的發(fā)生和進(jìn)展，而衰老CD8+T 細(xì)胞可以加重IR、全身炎癥反應(yīng)和慢性高血糖，因此這可能是其加重DR 的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示衰老CD8+T 細(xì)胞與 HOMA-IR、FPG 呈正相關(guān)，Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，病程、HOMA-IR、PLR 和衰老CD8+T 細(xì)胞是DR 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，均與上述研究結(jié)果符合。

綜上所述，T2DM 患者外周血衰老CD8+T 細(xì)胞水平明顯升高，合并DR 者更高，衰老CD8+T 細(xì)胞水平升高可能與DR的發(fā)生相關(guān)?？紤]到T2DM 相關(guān)并發(fā)癥很難僅通過血糖控制來治療，以衰老細(xì)胞為靶點(diǎn)可能是更有效的治療選擇。因此我們需要更大規(guī)模的前瞻性研究和復(fù)雜的機(jī)制實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)免疫衰老的調(diào)節(jié)是否是DR 潛在的新治療靶點(diǎn)。

表1 各組一般臨床及生化指標(biāo)比較

表2 各組外周血T 細(xì)胞頻率比較

表3 CD8+衰老T 細(xì)胞和臨床各指標(biāo)的相關(guān)性分析(r)

表4 二元Logistic 回歸分析DR 的危險(xiǎn)因素