楊兆利 白紅英 閆道杰

慢性乙型肝炎患者可因肝臟反復(fù)損傷、纖維化進(jìn)而發(fā)展為乙型肝炎肝硬化，常伴隨門靜脈高壓等多種并發(fā)癥，甚至合并肝癌。循環(huán)游離DNA(circulating free DNA, cfDNA)是細(xì)胞凋亡和(或)組織損傷的標(biāo)志物，通常由受損的組織細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等釋放，其在血液循環(huán)中的表達(dá)水平可反映組織細(xì)胞的損傷程度。目前已發(fā)現(xiàn),cfDNA與癌癥、創(chuàng)傷、膿毒癥、心肌梗死等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。因此，有研究[1-2]認(rèn)為cfDNA具有一定的預(yù)后預(yù)測(cè)能力，但其對(duì)乙型肝炎肝硬化失代償期患者預(yù)后評(píng)估作用，尚少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬觀察血清乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)cfDNA水平變化在乙型肝炎肝硬化失代償期患者預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年7月—2015年7月在濟(jì)南市人民醫(yī)院診治的乙型肝炎肝硬化失代償期患者112例，其中，男78例、女34例;年齡為(51.1±9.8)歲,病程5～20年。Child-Pugh A級(jí)39例，年齡為(51.3±8.7)歲；B級(jí)31例，年齡為(50.1±10.8)歲；C級(jí)42例，年齡為(52.4±7.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《病毒性肝炎防治方案》[3]中的失代償期肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)；初始應(yīng)用阿德福韋酯+拉米夫定或替比夫定+阿德福韋酯抗病毒治療；無(wú)自身免疫性肝炎；預(yù)計(jì)生存期>1年；無(wú)其他嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不全；②伴有嚴(yán)重心血管和呼吸系統(tǒng)疾病；③合并惡性腫瘤；④行脾切除術(shù)或經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門腔分流術(shù)等手術(shù)；⑤合并原發(fā)性腎臟疾??；⑥因血液系統(tǒng)疾病和非肝病原因死亡；⑦因巴德-吉亞利綜合征、門靜脈畸形等引起的食管靜脈曲張破裂出血者。選擇同期年齡、性別相匹配的32例門診健康體檢者作為對(duì)照組，其中男21例、女11例，年齡為(51.4±10.9)歲。112例患者與32例健康體檢者性別和年齡的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核和批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為2014lw-2)，所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 分組比較cfDNA的差異 根據(jù)Child-Pugh分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將112例患者分為Child-Pugh A級(jí)組、Child-Pugh B級(jí)組和Child-Pugh C級(jí)組；根據(jù)是否出現(xiàn)上消化道出血分為出血組(48例)和未出血組(64例)；根據(jù)肝靜脈壓力梯度(hepatic venous pressure gradient,HVPG)分為高HVPG組(>20 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa,50例)、中HVPG組(15～20 mmHg，29例)和低HVPG組(10～<15 mmHg，33例)。比較對(duì)照組與各病例組間血清cfDNA的差異。

1.3 血清cfDNA的定量檢測(cè) 取5 μL血清樣品，用雙蒸水稀釋至100 mL。用Tris-EDTA(TE)緩沖液(上海生工生物工程有限公司)稀釋人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液(北京孚博生物科技有限公司)至0、 50、 100、 200和400 μg/L質(zhì)量濃度。將測(cè)試樣品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋并置于95 ℃的坩堝中加熱5 min使DNA解鏈，隨即將其快速置于冰上以維持單鏈狀態(tài)。將含有50%裂解液、1 μg/L蛋白酶K(南京金斯瑞生物科技有限公司)的90 μL探針準(zhǔn)備液和10 μL測(cè)試樣品加入到96孔板中(均檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔)，用錫箔密封，置于55 ℃雜交箱中孵育過(guò)夜，用緩沖液洗滌96孔板3次，依次加入前擴(kuò)增探針、擴(kuò)增探針，以55 ℃保持1 h，共洗滌3次，然后加入標(biāo)記探針，以50 ℃保持1 h，洗滌3次后，加入堿性磷酸酶底物催化劑(dioxetane,北京孚博生物科技有限公司)，用錫箔密封，在室溫下靜置5～10 min，顯影發(fā)光，應(yīng)用微孔板發(fā)光儀(美國(guó)Promega公司)檢測(cè)每個(gè)孔光子數(shù)。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，檢測(cè)到的光子數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得濃度與光子數(shù)相關(guān)的方程式。然后，根據(jù)等式計(jì)算每孔的cfDNA水平，×20獲得每孔稀釋前的cfDNA水平。

1.4 預(yù)后影響因素的研究 對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行電話隨訪，直至患者發(fā)生終點(diǎn)事件或研究結(jié)束，終點(diǎn)事件定義為患者死亡。分析生存組與死亡組患者入院時(shí)的合并癥、臨床模型評(píng)分和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果;本研究截止日期為2019年6月30日。

2 結(jié) 果

2.1 不同分組法各組患者血清cfDNA水平及其生存情況 與對(duì)照組相比，不同Child-Pugh分級(jí)組患者血清cfDNA均顯著升高(P值均<0.05)，且B級(jí)組患者血清cfDNA顯著高于A級(jí)組(P<0.05)，C級(jí)組顯著高于B級(jí)組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，出血組與未出血組患者血清cfDNA均顯著升高(P<0.05)，且出血組患者血清cfDNA顯著高于未出血組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，不同HVPG組患者血清cfDNA均顯著升高 (P值均<0.05)，且中HVPG組患者血清cfDNA顯著高于低HVPG組(P<0.05)，高HVPG組患者血清cfDNA顯著高于中HVPG組(P<0.05)。對(duì)各組患者48個(gè)月的生存情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，Child-Pugh C級(jí)組患者病死率顯著高于Child-Pugh B級(jí)組患者，Child-Pugh B級(jí)組患者病死率顯著高于Child-Pugh A級(jí)組患者(P值均<0.05)；出血組患者病死率顯著高于未出血組(P<0.05)；高HVPG組患者病死率顯著高于中HVPG組患者，中HVPG組患者病死率顯著高于低HVPG組患者(P值均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同分組法的乙型肝炎肝硬化患者與對(duì)照組血清cfDNA水平和48個(gè)月生存情況比較

2.2 臨床資料分析結(jié)果 比較生存組與死亡組之間所有實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、臨床模型評(píng)分、合并癥的差異，分析得出18項(xiàng)參數(shù)P<0.1，納入下一步回歸分析。見(jiàn)表2。

2.3 單因素Cox回歸分析對(duì)預(yù)后有影響的因素 將生存組與死亡組比較后得出的18個(gè)預(yù)后因素逐一納入Cox回歸模型中進(jìn)行單因素分析，對(duì)分類變量賦值，其原則：①自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(SBP)、肝腎綜合征，“無(wú)”=0，“有”=1；②肝性腦病，“無(wú)”=0，“1或2級(jí)”=1，“3或4級(jí)”=2；③腹水，“無(wú)”=0，“少量”=1，“中等或大量”=2；④其余分類變量，“陰性”=0，“陽(yáng)性”=1。計(jì)量資料用實(shí)測(cè)值或?qū)⑵溥M(jìn)行對(duì)數(shù)變換后進(jìn)行單因素Cox回歸，共有14項(xiàng)因素與預(yù)后相關(guān)(P值均<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 多因素Cox回歸分析結(jié)果 將單因素Cox回歸分析得出的14項(xiàng)預(yù)后危險(xiǎn)因素納入多因素Cox回歸模型進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示腹水量、肝腎綜合征、cfDNA水平、INR、Child-Pugh評(píng)分和終末期肝病模型(MELD)評(píng)分為預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)。見(jiàn)表4。

表2 生存組與死亡組比較得出可能影響預(yù)后的參數(shù)

表3 乙型肝炎肝硬化失代償期患者單因素Cox回歸分析對(duì)預(yù)后有影響的因素

表4 乙型肝炎肝硬化失代償患者多因素Cox回歸分析結(jié)果

2.5 血清cfDNA水平評(píng)價(jià)乙型肝炎肝硬化失代償預(yù)后的效能 以血清cfDNA實(shí)測(cè)值為檢測(cè)變量，以分組為狀態(tài)變量，定義狀態(tài)變量值為1，繪制ROC曲線，見(jiàn)圖1。ROC曲線顯示: 3 406.34 μg/L為最佳截?cái)嘀?，此時(shí)的AUC最大(0.74)，其中，cfDNA>3 406.34 μg/L者64例，占57.1%；cfDNA≤3 406.34 μg/L者48例，占42.9%。提示當(dāng)cfDNA≤3 406.34 μg/L時(shí)，患者預(yù)后好，生存率高；當(dāng)cfDNA>3 406.34 μg/L時(shí)，患者預(yù)后差，病死率高。

2.6 血清cfDNA水平與患者預(yù)后的關(guān)系 以血清cfDNA 3 406.34 μg/L為截?cái)嘀?，將患者分為低水平cfDNA組與高水平cfDNA組，并繪制累積生存函數(shù)曲線，從圖中得出低水平cfDNA組和高水平cfDNA組24個(gè)月的累積生存率分別為89.6%和78.1%，48個(gè)月累積生存率分別為68.8%和45.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖1 乙型肝炎肝硬化失代償期患者血清cfDNA水平的ROC曲線

圖2 高水平cfDNA組與低水平cfDNA組乙型肝炎肝硬化失代償期患者生存情況比較

3 討 論

cfDNA是釋放到血清中的游離DNA片段，可在血液中自由循環(huán),由小片段(70～200 bp)和較大片段(21 000 bp)組成[4-5]，在健康人和患者的血清中均可檢測(cè)出。cfDNA在體液中處于一種動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，已有研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，血清cfDNA水平顯著升高。推測(cè)健康人體內(nèi)cfDNA起源于淋巴細(xì)胞或其他有核細(xì)胞[6-7]，另外有部分cfDNA由受損的組織細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等釋放，因此與很多疾病密切相關(guān)[8-9]。目前，cfDNA可作為一種有效的生物學(xué)標(biāo)志物用于多種疾病的評(píng)估，包括但不限于癌癥、胎兒醫(yī)學(xué)、創(chuàng)傷、敗血癥、無(wú)菌性炎癥和鐮狀細(xì)胞貧血等。

乙型肝炎肝硬化是臨床上常見(jiàn)的慢性進(jìn)行性肝病，如病情持續(xù)進(jìn)展將進(jìn)入失代償期，對(duì)患者的健康造成極大威脅[10-11]。因此，臨床上亟待尋找一種準(zhǔn)確、客觀、實(shí)用的檢測(cè)指標(biāo)，用于對(duì)患者疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的有效評(píng)估。目前已發(fā)現(xiàn)乙型肝炎攜帶者血清cfDNA水平顯著高于健康人，同時(shí)也有研究指出血清cfDNA水平與乙型肝炎相關(guān)的原發(fā)性肝癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，表明cfDNA可能是預(yù)測(cè)HBV疾病預(yù)后的重要標(biāo)志物[12]。乙型肝炎患者血清cfDNA水平升高的原因可能為乙型肝炎病毒的復(fù)制導(dǎo)致了肝細(xì)胞損傷，并產(chǎn)生大量炎癥因子，此過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)DNA降解為小片段，并釋放進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血清cfDNA水平顯著升高[13-14]。

早期研究只提出cfDNA水平在乙型肝炎患者中顯著升高，并且其血清水平可能與由乙型肝炎肝硬化導(dǎo)致的肝癌具有相關(guān)性。本研究將乙型肝炎肝硬化失代償期患者按照Child-Pugh分級(jí)、HVPG、是否合并上消化道出血進(jìn)行分組，并探討各分組血清cfDNA水平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各分組患者血清cfDNA水平均高于對(duì)照組，且患者血清cfDNA水平隨著Child-Pugh分級(jí)和HVPG升高，以及并發(fā)上消化道出血現(xiàn)象而升高。這一結(jié)果提示血清cfDNA水平與患者病情相關(guān)。

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型主要用于生存資料的影響因素分析與多變量生存預(yù)測(cè)，且可以排除變量之間的相互干擾。本研究采用Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素回歸分析，最終篩選出7個(gè)對(duì)預(yù)后有影響的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中血清cfDNA水平也可用于對(duì)乙型肝炎肝硬化的預(yù)后評(píng)估。采用ROC曲線確定血清cfDNA水平的截?cái)嘀?，并根?jù)截?cái)嘀祵⑺醒芯繉?duì)象分為高cfDNA和低cfDNA兩組。統(tǒng)計(jì)顯示，高cfDNA組患者預(yù)后顯著差于低cfDNA組。本研究提示，血清cfDNA檢測(cè)可成為臨床醫(yī)師評(píng)估乙型肝炎肝硬化失代償期患者預(yù)后的一種標(biāo)志物，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。