熊 玥, 汪 澄, 劉建暉, 石慧慧, 汪云花, 孫 瑤, 于 潔

(1. 江蘇省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所, 江蘇 南京 210036; 2. 上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司, 上海 200335)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,動(dòng)物疫病的形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。為滿足部分養(yǎng)殖者片面追求療效、增加養(yǎng)殖密度等需求,少數(shù)獸藥企業(yè)不按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定處方生產(chǎn),隨意改變產(chǎn)品配方或是非法添加其他藥物,以期擴(kuò)大產(chǎn)品銷路,尋求更高收益。近年來,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已發(fā)布了50多種獸藥非法添加物檢查方法,但檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定速度仍然跟不上企業(yè)非法添加物調(diào)整變化的步伐[1]。2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第289號(hào)《獸藥中非特定非法添加物質(zhì)檢查方法》[2]的頒布實(shí)施,為獸藥中未知添加物的篩查與確證工作提供了判定依據(jù),解決了目前獸藥檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)于使用非標(biāo)方法篩查出來的結(jié)果無法出具帶有法律效應(yīng)的報(bào)告,而使不合格獸藥難以得到有效查處的尷尬局面。

目前,藥品、食品、保健品、化妝品、農(nóng)藥中非法添加物的篩查確證主要基于兩種模式。一是靶向篩查模式,利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)(HPLC-PDA)法[3,4]、超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)法[5,6]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[7,8]等收集化合物的保留時(shí)間、光譜圖、母離子精確質(zhì)荷比、二級(jí)碎片譜圖等信息,建立數(shù)據(jù)庫。再使用軟件將樣品數(shù)據(jù)與譜庫進(jìn)行比對(duì),如有匹配結(jié)果,可在相同條件下進(jìn)適宜濃度的對(duì)照品溶液獲得相關(guān)譜圖進(jìn)行確證。靶向篩查法又可稱為譜庫比對(duì)法,未知物的檢出率主要依賴數(shù)據(jù)庫的大小,對(duì)于未收入譜庫的化合物有漏篩的風(fēng)險(xiǎn),存在一定的局限性。二是非靶向篩查模式,利用多種方法聯(lián)用技術(shù)對(duì)譜庫中未收集的化合物進(jìn)行推測(cè)分析,常收集高分辨質(zhì)譜提供的精確質(zhì)荷比、同位素分布及二級(jí)碎片信息,使用軟件擬合出未知物的分子式,并對(duì)主要二級(jí)碎片進(jìn)行解析,推測(cè)未知物的主要官能團(tuán)和裂解途徑,推導(dǎo)出未知物的疑似結(jié)構(gòu),并設(shè)法獲取相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)行確證。有需要時(shí),可通過制備液相色譜等手段對(duì)樣品進(jìn)行分離純化,得到目標(biāo)物后再利用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜、質(zhì)譜等現(xiàn)代波譜解析方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),提高結(jié)果的準(zhǔn)確度[9,10]。對(duì)于這種非靶向篩查,除了分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)外,還要關(guān)注產(chǎn)品本身的療效用途,結(jié)合商品名、包裝宣傳等信息,進(jìn)行大膽合理的推斷。

近日,在對(duì)一批獸藥恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)進(jìn)行處方外非法添加物篩查時(shí),發(fā)現(xiàn)高響應(yīng)未知色譜峰。參考未知物非靶向篩查模式,通過分析高分辨質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù),結(jié)合該產(chǎn)品的臨床作用等信息,推導(dǎo)出疑似添加物,并用超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(UPLC-PDA)法和超高效液相色譜-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜(UPLC-TOF-HRMS)法進(jìn)行雙重驗(yàn)證,最終確證該批恩諾沙星粉中的非法添加物為亞硫酸氫鈉甲萘醌。本文的研究具有較好的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀配PDA檢測(cè)器及Empower 3 工作站(美國Waters公司); Triple TOF 4600超高效液相色譜-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀配OS及MasterView軟件(美國SCIEX公司); XS205DU分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純(美國Merck公司);水為超純水;其他試劑均為分析純(南京化學(xué)試劑股份有限公司)。甲萘醌對(duì)照品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(批號(hào)V0011304;含量99.3%);亞硫酸氫鈉甲萘醌原料購自云南陸良和平科技有限公司(批號(hào)CVS20190906C;以C11H9NaO5S·3H2O計(jì),為96.3%,作為對(duì)照品使用)。待測(cè)樣恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)為2019年度國家獸藥風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)樣品(批號(hào):1904011;規(guī)格:5%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1UPLC-PDA條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:2 μL;流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫:0～7.0 min, 95%A～40%A; 7.0～7.5 min, 40%A～95%A; 7.5～10 min, 95%A。二極管陣列檢測(cè)器,采集波長范圍210～400 nm,分辨率1.2 nm,記錄260 nm波長處的色譜圖。用于未知物的初篩及最后的未知物確證。

1.2.2UPLC-TOF-HRMS條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫:0～12.0 min,95%A～75%A;12.0～16.0 min,75%A～45%A;16.0～18.0 min,45%A;18.1～20.0 min,95%A;二極管陣列檢測(cè)器,記錄260 nm波長處的色譜圖(用于未知物結(jié)構(gòu)分析時(shí)確定未知物在質(zhì)譜圖中的保留時(shí)間)。采用ESI離子源,分別在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。正離子模式:電噴霧電壓為5 500 V,溫度為550 ℃,霧化氣體為N2,霧化氣壓力344.75 kPa(50 psi),輔助霧化氣壓力344.75 kPa(50 psi),氣簾氣為241.32 kPa(35 psi);一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為100～1 000 Da,去簇電壓為80 V;碰撞能量為10 eV;二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為50～1 000 Da,去簇電壓為80 V,碰撞能量為35 eV,碰撞電壓擴(kuò)展能量為15 eV;開啟動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)。負(fù)離子模式:噴霧電壓為-4 500 V;一級(jí)質(zhì)譜去簇電壓為-80 V,碰撞能量為-10 eV;二級(jí)質(zhì)譜去簇電壓為-80 V,碰撞能量為-35 eV;其他條件同正離子模式。

1.3 溶液的制備

1.3.1酸性供試品溶液的制備

UPLC-PDA酸性初篩溶液: 稱取供試品0.5 g,置具塞錐形瓶中,加甲酸-甲醇-水(1∶250∶250, v/v/v)溶液250.0 mL,搖勻,超聲10 min,冷卻至室溫,濾過,取濾液,即得。

UPLC-TOF-HRMS酸性推導(dǎo)溶液: 用甲醇-水(1∶1, v/v)溶液將酸性初篩溶液稀釋制成每1 mL約含恩諾沙星500 ng的溶液,即得。

1.3.2堿性供試品溶液的制備

UPLC-PDA堿性初篩溶液: 稱取供試品0.5 g,置具塞錐形瓶中,加碳酸鈉試液(取無水碳酸鈉10.5 g,加水溶解成100 mL)20.0 mL,振搖1 min,再加甲醇-水(250∶250, v/v)溶液230.0 mL,搖勻,超聲10 min,冷卻至室溫,濾過,取濾液,即得。

UPLC-TOF-HRMS堿性推導(dǎo)溶液: 用甲醇-水(1∶1, v/v)溶液將堿性初篩溶液稀釋制成每1 mL約含恩諾沙星500 ng的溶液,即得。

1.3.3對(duì)照品溶液制備

UPLC-PDA對(duì)照品確證溶液: 取甲萘醌及亞硫酸氫鈉甲萘醌對(duì)照品各約10 mg,精密稱定,置100 mL量瓶中,加甲醇-水(1∶1, v/v)溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻;精密量取3 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇-水(1∶1, v/v)溶液稀釋至刻度,搖勻,即得。

UPLC-TOF-HRMS對(duì)照品確證溶液: 用甲醇-水(1∶1, v/v)溶液將UPLC-PDA對(duì)照品確證溶液稀釋制成每1 mL含100 ng的溶液,即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 未知物的發(fā)現(xiàn)和初步分析

取UPLC-PDA酸性初篩溶液、堿性初篩溶液,按1.2.1節(jié)條件分別進(jìn)樣,見圖1。酸性初篩溶液色譜圖中除在2.376 min出現(xiàn)恩諾沙星主峰外,分別在1.870 min(未知物1)及5.122 min(未知物2)處出現(xiàn)未知色譜峰,最大吸收波長分別為229.0 nm及249.1 nm,將未知峰光譜圖與常見獸藥及非法添加物光譜圖庫進(jìn)行比對(duì),未發(fā)現(xiàn)匹配的結(jié)果。堿性初篩溶液色譜圖中除恩諾沙星主峰外,未出現(xiàn)保留時(shí)間為1.870 min的未知峰,在5.122 min處出現(xiàn)與酸性初篩溶液色譜圖中未知物2保留時(shí)間及光譜圖一致的色譜峰,且峰面積增大近10倍。提示未知物1與未知物2在酸性/堿性條件下可能發(fā)生轉(zhuǎn)化。

2.2 未知物結(jié)構(gòu)推斷

按1.2.2節(jié)條件分別采集正離子模式和負(fù)離子模式下UPLC-TOF-HRMS堿性推導(dǎo)溶液、酸性推導(dǎo)溶液的色譜圖,除恩諾沙星外,未檢出與譜庫相匹配的其他常見獸藥或非法添加物。故借助SCIEX OS軟件中的分子式擬合功能對(duì)未知物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo),并結(jié)合臨床應(yīng)用等其他信息作出推斷。

2.2.1未知物2結(jié)構(gòu)推導(dǎo)

查看正離子模式下采集的堿性推導(dǎo)溶液數(shù)據(jù),對(duì)總離子流圖進(jìn)行基峰提取(即把一段時(shí)間內(nèi)響應(yīng)比較高的信號(hào)提取出來,簡稱BPC),發(fā)現(xiàn)16.747 min處有與紫外色譜圖中未知物2保留時(shí)間(tR=16.736 min)相近的一個(gè)峰(見圖2),該峰的精確質(zhì)荷比為173.059 6(173.059 8)(見圖3)。

圖 1 酸性初篩溶液和堿性初篩溶液的色譜圖及紫外光譜圖Fig. 1 Chromatograms and UV spectra of acid test solution and alkaline test solution

圖 2 堿性推導(dǎo)溶液正離子模式下的(a)BPC圖及(b)紫外色譜圖Fig. 2 (a) Base peak chromatogram (BPC) and (b) UV chromatogram of alkaline test solution in positive ion mode

圖 3 未知物2的(a)精確質(zhì)荷比及同位素分布圖和(b)二級(jí)碎片圖Fig. 3 (a)Precise m/z, natural isotope distribution and(b) fragment ion spectrum of unknown compound 2

圖 4 未知物2結(jié)構(gòu)推測(cè)Fig. 4 Structure prediction of unknown compound 2

圖 5 酸性推導(dǎo)溶液負(fù)離子模式下的(a)BPC圖及(b)紫外色譜圖Fig. 5 (a) BPC and (b) UV chromatogram of acid test solution in negative ion mode

2.2.2未知物1結(jié)構(gòu)推導(dǎo)

圖 6 未知物1的(a)精確質(zhì)荷比及同位素分布圖和(b)二級(jí)碎片圖Fig. 6 (a)Precise m/z, natural isotope distribution and(b) fragment ion spectrum of unknown compound 1

圖 7 未知物1的裂解途徑Fig. 7 Fragmentation pathway of unknown compound 1

2.2.3未知物的推斷

從樣品的臨床應(yīng)用及商品名入手,恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的出血性敗血癥等[12],在中國獸藥信息網(wǎng)國家基礎(chǔ)獸藥庫中查詢?cè)摦a(chǎn)品的商品名,多與止血作用相關(guān),如“出血停”、“魚血止”等[13],與亞硫酸氫鈉甲萘醌臨床作用[14]相近。另有報(bào)道,亞硫酸氫鈉甲萘醌在堿性溶液中析出甲萘醌[15],為UPLC-PDA初篩的實(shí)驗(yàn)結(jié)論提供佐證。最后結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果,推測(cè)該未知物1為亞硫酸氫鈉甲萘醌,未知物2為甲萘醌。為進(jìn)一步增強(qiáng)質(zhì)譜信息的可信度,推導(dǎo)了可能裂解的途徑,見圖7和圖8。

圖 8 未知物2的裂解途徑Fig. 8 Fragmentation pathway of unknown compound 2

2.3 未知物確證

2.3.1HPLC-PDA法確證

將初篩溶液色譜圖中的未知物1、未知物2色譜峰分別與UPLC-PDA對(duì)照品確證溶液中主峰的保留時(shí)間及紫外光譜進(jìn)行比對(duì)(見圖1和圖9)。在該試驗(yàn)條件下,未知物1與對(duì)照品溶液中亞硫酸氫鈉甲萘醌的保留時(shí)間一致,紫外光譜相似;未知物2與對(duì)照品溶液中甲萘醌的保留時(shí)間一致,紫外光譜相似。

利用不同濃度本底添加對(duì)供試品中的未知物進(jìn)行驗(yàn)證(取酸性初篩溶液與UPLC-PDA對(duì)照品確證溶液按1∶4、1∶1、4∶1的比例混合),使用Waters Empower 3軟件進(jìn)行峰純度及庫匹配檢查,結(jié)果顯示:添加前后,供試品色譜圖各相應(yīng)位置上的色譜峰的純度角度均小于純度閾值,可認(rèn)為是單一物質(zhì)峰;光譜相似度檢查結(jié)果顯示:添加前后,供試品色譜圖相應(yīng)位置上的色譜峰的光譜匹配角度均小于匹配閾值,表明與對(duì)照品的紫外光譜相似,可認(rèn)為是同一化合物。判定未知峰1為亞硫酸氫鈉甲萘醌,未知峰2為甲萘醌。峰純度檢查和光譜相似度檢查結(jié)果見表1。

表 1 未知物1峰純度檢查與光譜相似度檢查結(jié)果

圖 9 對(duì)照品溶液中亞硫酸氫鈉甲萘醌和甲萘醌的色譜圖及紫外光譜圖Fig. 9 Chromatograms and UV spectra of menadione sodium bisulfite and menadione standards

圖 10 (a)未知物1與(b)譜庫中亞硫酸氫鈉甲萘醌對(duì)照品的匹配圖Fig. 10 Matching diagrams between (a) unknown compound1 and (b) menadione sodium bisulfite reference substance in the library

圖 11 (a)未知物2與(b)譜庫中甲萘醌對(duì)照品的匹配圖Fig. 11 Matching diagrams between (a) unknown compound 2 and (b) menadione reference substance in the library

2.3.2UPLC-TOF-HRMS法確證

在相同條件下,采集對(duì)照品母離子的精確質(zhì)荷比、天然同位素分布、二級(jí)譜圖、保留時(shí)間四大信息,載入軟件譜庫中。使用SCIEX MasterView軟件將酸性推導(dǎo)溶液中提取到的未知物1信息與亞硫酸氫鈉甲萘醌對(duì)照譜圖進(jìn)行比較,兩者保留時(shí)間一致,一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量偏差為1.0×10-6,二級(jí)譜庫匹配度為100%,見圖10。將堿性推導(dǎo)溶液中提取到的未知物2信息與甲萘醌對(duì)照譜圖進(jìn)行比較,兩者保留時(shí)間一致,一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量偏差為0.6×10-6,二級(jí)譜庫匹配度為99.7%,見圖11。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第289號(hào)《獸藥中非特定非法添加物質(zhì)檢查方法》液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[5]進(jìn)行結(jié)果判定,供試品色譜圖中如出現(xiàn)與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致的色譜峰(保留時(shí)間相對(duì)偏差不大于2.5%);供試品與對(duì)照品分子離子峰的質(zhì)量數(shù)偏差不大于5×10-6,且二級(jí)質(zhì)譜圖與對(duì)照品的二級(jí)質(zhì)譜圖一致,判定該供試品中檢出的未知物1為亞硫酸氫鈉甲萘醌,未知物2為甲萘醌。

2.4 本研究中未知物推導(dǎo)確證思路

該樣品中未知物1亞硫酸氫鈉甲萘醌本身在正離子模式下沒有響應(yīng),負(fù)離子模式下裂解產(chǎn)物僅為一個(gè)大的碎片離子,信息量過少,不易于進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)的推導(dǎo)。但其在堿性條件下可轉(zhuǎn)換為甲萘醌,甲萘醌在負(fù)離子模式下無響應(yīng),但在正離子模式下有響應(yīng)且碎片信息較多,可用于結(jié)構(gòu)推導(dǎo)和解析,為未知物的確證提供了有力的佐證。

2.5 非法添加原因分析

恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)臨床上用于治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物由細(xì)菌性感染引起的出血性敗血癥、爛鰓病、打印病、腸炎病、赤鰭病、愛德華氏菌病等疾病[12]。亞硫酸氫鈉甲萘醌是水溶性維生素類藥物,缺乏會(huì)影響凝血過程而引起出血,口服可直接吸收,達(dá)到止血作用,臨床上常用于輔助治療魚、鰻等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的出血、敗血癥[12]。不法企業(yè)在恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)中添加亞硫酸氫鈉甲萘醌“增強(qiáng)”產(chǎn)品療效,以期達(dá)到“多病同治”的效果。由于亞硫酸氫鈉甲萘醌不穩(wěn)定[16],在存放過程中分解出甲萘醌,導(dǎo)致供試品中有少量甲萘醌檢出。有文獻(xiàn)報(bào)道在魚類發(fā)生嚴(yán)重貧血、肝功能喪失的情況下,使用亞硫酸氫鈉甲萘醌不但沒有治療作用,反而不利于病魚的康復(fù),甚至在治療期間,使病情惡化,死魚數(shù)量成倍增加[17]。故在恩諾沙星粉中非法添加亞硫酸氫鈉甲萘醌可能引起潛在的、不可估量的危害。

3 結(jié)論

本文使用UPLC-TOF-HRMS及其數(shù)據(jù)處理軟件,依靠其高質(zhì)量精度和分子式預(yù)測(cè)功能,綜合二級(jí)質(zhì)譜解析和臨床應(yīng)用等信息,對(duì)一批獸藥恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)中的未知物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定,做出了合理推斷。近年來,獸藥中非法添加藥物屢禁不止,相較于畜禽藥,水產(chǎn)藥因?yàn)殛P(guān)注度較低,已成為重災(zāi)區(qū)。本研究中樣品按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正常檢驗(yàn),所有項(xiàng)目均符合規(guī)定,提示檢驗(yàn)員對(duì)檢驗(yàn)中出現(xiàn)的異常色譜峰應(yīng)特別關(guān)注。HRMS能進(jìn)行全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集,不僅能夠一次性分析大量的目標(biāo)化合物,還能在不用相關(guān)對(duì)照品的前提下檢測(cè)多種非目標(biāo)化合物[18,19]。通過HRMS技術(shù)進(jìn)行定性篩查已成為一種趨勢(shì),現(xiàn)已有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第197號(hào)(可用于同時(shí)鑒別和確認(rèn)150種獸藥及其他化合物)[20]、《食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法工作規(guī)定》BJS 201805(可同時(shí)篩查和定性確證90種那非類物質(zhì))[21]等多部利用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行化合物篩查及確證的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái),其強(qiáng)大的篩查功能將對(duì)不法分子產(chǎn)生極大的震懾作用,為行政執(zhí)法提供充分的技術(shù)保障。