張夢(mèng)婷, 張育露, 王浩江, 李 寧, 李 波, 肖 虹, 卞 偉*, 蔡宗葦

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山西 太原 030001; 2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科, 山西 太原 030001; 3. 香港浸會(huì)大學(xué)化學(xué)系環(huán)境與生物分析國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 香港 999077)

乳腺癌是導(dǎo)致婦女因癌癥死亡的主要原因之一,它是一種高度異質(zhì)性疾病,包括幾種亞型[1]。目前,早期乳腺癌的死亡率已大大降低,遠(yuǎn)低于40年前的水平,治愈率為90%,但是面對(duì)晚期乳腺癌的治療和治愈后的復(fù)發(fā)仍然存在挑戰(zhàn)[2]。基于分子亞型的不同,乳腺癌表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)模式,主要由雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2的狀態(tài)表達(dá)情況決定[3]。乳腺癌的早期診治中需要更精確地評(píng)估敏感的生物標(biāo)記物,在分子水平上對(duì)乳腺癌進(jìn)行精確的診斷和分型,提高乳腺癌的診斷和預(yù)后情況,指導(dǎo)分子靶向治療。

質(zhì)譜成像(mass spectrometry imaging, MSI)作為一種免標(biāo)記的分子成像技術(shù),可直接獲取藥物及其代謝物以及脂質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)等內(nèi)源性代謝物在組織中的分子信息和空間分布信息,在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。基于電離方式不同,常見(jiàn)的質(zhì)譜成像技術(shù)可分為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging, MALDI-MSI)[4],解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像(desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, DESI-MSI)[5]和二次離子質(zhì)譜成像(secondary ion mass spectrometry mass spectrometry imaging, SIMS-MSI)[6]。

表 1 不同電離方式在檢測(cè)小分子時(shí)的難點(diǎn)及解決方法

質(zhì)譜成像分析的一般流程為組織獲取、切片制備、質(zhì)譜電離、圖譜獲取和數(shù)據(jù)分析。樣品前處理是影響MSI結(jié)果的關(guān)鍵步驟,處理方法與待測(cè)物性質(zhì)和樣品類型密切相關(guān),正確的樣品制備可以保持分子的來(lái)源、分布和豐度,獲得高質(zhì)量的信號(hào)和足夠的空間分辨率[7]。在MALDI-MSI中,基質(zhì)的選擇和噴涂方式同樣決定了成像分析的結(jié)果。本綜述介紹了質(zhì)譜成像技術(shù)中對(duì)于不同類型樣品的處理及其在乳腺癌不同研究模型的應(yīng)用進(jìn)展,為開(kāi)展乳腺癌的精準(zhǔn)診斷和分型提供依據(jù)。

1 MSI樣品處理

MSI樣品處理的方法與樣品類型、待測(cè)物自身的性質(zhì)相關(guān),基本過(guò)程包括收集樣品、儲(chǔ)存、切片、組織預(yù)處理、基質(zhì)噴涂等方面。樣品制備對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性至關(guān)重要,顯著影響MSI的分辨率、靈敏度和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.1 小分子

內(nèi)源性代謝物,包括低相對(duì)分子質(zhì)量代謝物(m/z<500)和脂質(zhì),是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分,它們?cè)诩?xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),氧化應(yīng)激反應(yīng)和能量代謝中起著至關(guān)重要的作用。小分子代謝物的成像可以采用DESI、nano-DESI、MALDI等離子源或者不同的電離方式(見(jiàn)表1)。使用DESI和nano-DESI對(duì)生物樣品進(jìn)行成像時(shí)只需要很少的樣品預(yù)處理步驟甚至不需要進(jìn)行處理。Nguyen等[13]使用甲醇和水組成的常用脂質(zhì)萃取溶劑對(duì)小鼠肺部組織中的脂質(zhì)進(jìn)行了nano-DESI-MSI分析,實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠肺組織中20個(gè)脂質(zhì)亞類中的265種獨(dú)特脂質(zhì)和19種代謝物(共284種)的鑒定,覆蓋率達(dá)到40%。實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到的脂質(zhì)可能是由于該類脂質(zhì)的含量低、萃取劑對(duì)其萃取效率低或脂質(zhì)的離子化程度低。在萃取劑中添加陽(yáng)離子試劑可以增強(qiáng)特定脂質(zhì)的離子化程度,例如Duncan等[8]在萃取溶劑中添加Ag+,實(shí)現(xiàn)了對(duì)含量較低的前列腺素的nano-DESI-MSI分析。組織基質(zhì)中的離子抑制效應(yīng)對(duì)藥物的質(zhì)譜成像有較大的影響,是MSI在臨床藥物研究中所面臨的難點(diǎn)和重點(diǎn)問(wèn)題。Song等[14]開(kāi)發(fā)了一種原位水凝膠調(diào)節(jié)方法,來(lái)增強(qiáng)空氣輔助解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像(Air-flow-assisted desorption electrospray ionization-mass spectrometry imaging, AFADESI-MSI)的靈敏度。該方法使用固相水凝膠“沖洗”組織切片代替在溶劑中對(duì)其進(jìn)行沖洗或消化處理。并檢驗(yàn)了此方法對(duì)各種不同理化性質(zhì)藥物(如紫杉醇、羅紅霉素、利血平、雙氯芬酸等)的適用性。結(jié)果表明,該方法可以顯著降低水溶性季銨鹽和無(wú)機(jī)鹽對(duì)離子的抑制作用,將藥物信號(hào)增強(qiáng)2到25倍。

表 2 新基質(zhì)及其優(yōu)勢(shì)

使用MALDI-MSI對(duì)小分子進(jìn)行成像時(shí),會(huì)存在多種與基質(zhì)相關(guān)的離子信號(hào),干擾成像的結(jié)果和質(zhì)量。為了解決這個(gè)問(wèn)題,研究人員找到了新的基質(zhì)用于MALDI-MSI(見(jiàn)表2)。Sun等[9]應(yīng)用背景干擾小、靈敏度高、可同時(shí)應(yīng)用于正離子和負(fù)離子模式檢測(cè)的1,1′-聯(lián)萘-2,2′-二胺(BNDM)作為基質(zhì),實(shí)現(xiàn)了對(duì)大鼠大腦中氨基酸、有機(jī)酸、核苷、核苷酸、含氮堿基、膽固醇、多肽、脂肪酸、磷脂酰乙醇胺等301個(gè)負(fù)代謝物離子和膽堿、肉堿、多胺、肌酸、磷脂酰膽堿等175個(gè)正代謝物離子的成像,通過(guò)探索整體脂質(zhì)的變化來(lái)發(fā)現(xiàn)與病理狀態(tài)相關(guān)的功能分子。圖1為用BNDM作為MALDI-MSI的新基質(zhì)檢測(cè)大鼠大腦中代謝物的示意圖。Guan等[15]使用聚乙烯吡咯烷酮包被的銀納米顆粒(AgNPs)作為MALDI-MSI的基質(zhì),實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦組織中脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂和固醇的同時(shí)成像。

圖 1 BNDM作為MALDI-MSI的新基質(zhì)檢測(cè)代謝物的示意圖[9]Fig. 1 Schematic diagram of BNDM as a new matrix of MALDI-MSI for detection of metabolites[9]

研究發(fā)現(xiàn)非傳統(tǒng)基質(zhì)和基質(zhì)添加劑可為分析中性脂質(zhì)提供優(yōu)勢(shì)。Dufresne等[17]提出了一種用MALDI-MSI檢測(cè)中性脂質(zhì)的樣品制備方法,使用Na2CO3或Na3PO4向組織切片中摻入鈉,然后進(jìn)行2,5-二羥基苯甲酸(DHB)升華。此方法能夠檢測(cè)幾種中性脂質(zhì),例如膽固醇酯類、羊毛甾醇酯、甘油二酯、腦苷脂和甘油三酯。這種方法已成功應(yīng)用于腦、腎、肝和腎上腺的MALDI-MSI實(shí)驗(yàn)。相較于之前報(bào)道的中性脂質(zhì)的檢測(cè)方法,這種方法能夠以5 μm的空間分辨率使中性脂質(zhì)可視化。

脂質(zhì)組中含有較多的碳碳雙鍵位置異構(gòu),這給脂質(zhì)的精確結(jié)構(gòu)分析和定量分析帶來(lái)挑戰(zhàn)。Bednarik等[11]利用Paternò-Büchi(PB)反應(yīng),使用苯甲醛作為衍生化試劑,將脂質(zhì)分子中的碳碳雙鍵選擇性衍生化,實(shí)現(xiàn)了對(duì)高不飽和磷脂和糖脂中碳碳雙鍵的定位分析。游離脂肪酸(FFAs)參與信號(hào)分子的構(gòu)成,這些分子對(duì)體內(nèi)的許多代謝活動(dòng)如脂質(zhì)和葡萄糖代謝至關(guān)重要,但由于其相對(duì)分子質(zhì)量小,在組織中豐度低,電離效率差,給其檢測(cè)帶來(lái)困難。Wang等[12]使用易于合成的試劑N,N-二甲基哌嗪碘化物(DMPI)建立了組織原位FFAs衍生化方法,該試劑可以在溫和條件下與脂肪酸反應(yīng),圖2為DMPI與脂肪酸反應(yīng)的示意圖,衍生的FFAs適用于以正離子模式檢測(cè)。通過(guò)使用這種衍生化試劑和已建立的衍生化方法,可以同時(shí)檢測(cè)和成像甲狀腺組織中的FFAs和磷脂(PLs),同時(shí)提高了檢出目標(biāo)分子的數(shù)量和方法靈敏度。

圖 2 脂肪酸與衍生試劑反應(yīng)示意圖[12]Fig. 2 Schematic diagram of the reaction between fatty acid and derivatization reagent[12] HATU: 2-(7-azabenzotrizol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate.

1.2 大分子

常見(jiàn)的生物大分子物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、多糖和核酸等,其相對(duì)分子質(zhì)量從幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)不等,在生物體內(nèi)存在量變和空間定位的變化,它們?cè)诩膊∩踔涟┌Y發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要功能。對(duì)大分子進(jìn)行檢測(cè)的離子源有MALDI、SIMS、DESI等。Nunez-Naveira等[18]用MALDI-TOF MSI對(duì)9例肺癌患者呼出氣冷凝物(EBC)中的蛋白質(zhì)分布進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)EBC中含較高濃度的皮離蛋白和S100A9; Mochiji等[19]使用氬氣團(tuán)簇離子源,通過(guò)SIMS-MSI檢測(cè)到了細(xì)胞色素C(12 327 Da)和糜蛋白酶(25 000 Da); Hsu等[20]通過(guò)nano-DESI檢測(cè)出質(zhì)量達(dá)到15 kDa的蛋白質(zhì)。

表 3 大分子成像前的切片洗滌方案

通過(guò)MALDI-MSI檢測(cè)組織樣品中高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)(>25 kDa)分布的一般方法需要先進(jìn)行原位酶解。原位酶解是將較大的蛋白質(zhì)水解為多肽,然后對(duì)生成的肽段進(jìn)行原位成像分析,常用的酶為胰蛋白酶[21]。組織切片清洗用于去除對(duì)測(cè)量靈敏度產(chǎn)生不利影響的脂質(zhì)、鹽和其他小分子。清洗方案需要根據(jù)目標(biāo)分析物進(jìn)行評(píng)估選擇,表3列舉了不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡南礈旆桨?。Bastrup等[25]將DHB和2-羥基-5-甲氧基苯甲酸混合,并添加磷酸,減少了背景信號(hào)的干擾,對(duì)阿爾茲海默癥病人大腦和淀粉樣前體蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的淀粉樣蛋白(Aβ)進(jìn)行MALDI成像,增強(qiáng)了對(duì)Aβ蛋白,特別是Aβ1-42的檢測(cè)效果。Piga等[26]以產(chǎn)生的質(zhì)譜峰數(shù)和平均信噪比為標(biāo)準(zhǔn),評(píng)估了不同的洗滌步驟,以及SunChrom自動(dòng)噴涂機(jī)不同的噴涂方式,使用MALDI-FTICR-MSI(matrix-assisted laser desorption/ionization-fourier transform ion cyclotron resonance-mass spectrometry imaging)分析小鼠和人胰腺組織中的完整蛋白,結(jié)果表明,在乙醇-水的基礎(chǔ)洗滌步驟中加入芥子酸,在噴涂時(shí)提高噴嘴的速度可以獲得較高質(zhì)量的圖譜。

1.3 基質(zhì)噴涂

在MALDI-MSI研究中,常用的基質(zhì)噴涂方法包括噴槍法、自動(dòng)噴霧法、升華法。噴槍法屬手動(dòng)方法,受人為因素影響,重現(xiàn)性較差。自動(dòng)噴霧法可以提供更均勻的基質(zhì)層,提高了重現(xiàn)性。用升華法噴涂基質(zhì)可以制備均勻的基質(zhì)結(jié)晶薄層,但是升華法會(huì)降低蛋白質(zhì)的提取效率。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)沉積后的重結(jié)晶可以提高蛋白質(zhì)的電離效率。Lin等[28]在基質(zhì)升華和水合作用之后,加入了超聲處理,發(fā)現(xiàn)m/z>10 000的蛋白質(zhì)信號(hào)顯著增強(qiáng)。通過(guò)升華進(jìn)行的基質(zhì)沉積一般使用標(biāo)準(zhǔn)玻璃升華器,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求可以進(jìn)行改進(jìn):Fernandez等[29]設(shè)計(jì)了一種不銹鋼升華器,可以更好地控制升華過(guò)程中的樣品溫度和室內(nèi)真空,使基質(zhì)沉積的可重復(fù)性達(dá)到5%。Nakashima等[30]將基質(zhì)均勻地涂覆在膠帶上,并通過(guò)導(dǎo)電膠帶附著在導(dǎo)電載玻片(indium-tin-oxide coated slide, ITO載玻片)上,然后將大鼠腦組織黏附到載玻片上。圖3為該方法制備的示意圖。與傳統(tǒng)方法相比,這種方法可以減少基質(zhì)沉積的時(shí)間和工作量,但是其得到的信號(hào)強(qiáng)度較低。

圖 3 基質(zhì)沉積方法示意圖[30]Fig. 3 Schematic diagram of matrix deposition method[30]

通過(guò)解吸電噴霧電離質(zhì)譜(DESI-MS)進(jìn)行蛋白質(zhì)分析時(shí),靈敏度會(huì)隨蛋白質(zhì)質(zhì)量增加而下降。為了克服此困難,Maser等[31]在DESI分析期間,使用潤(rùn)濕筆將預(yù)潤(rùn)濕的溶劑(含有乙腈和甲酸)噴涂到樣品上,增加了蛋白質(zhì)溶解時(shí)間,改善相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白)的成像分析。采用該方法可以直接從稀釋的山羊血清中檢測(cè)到白蛋白和相對(duì)分子質(zhì)量更大的蛋白質(zhì)。

1.4 石蠟包埋樣品的處理

圖 4 對(duì)FFPE組織進(jìn)行MALDI MSI肽分析的工作流程[33]Fig. 4 Workflow of MALDI MSI peptide analysis for FFPE tissue[33]

與新鮮腫瘤樣品相比,石蠟包埋組織被廣泛應(yīng)用于人體腫瘤組織的保存,導(dǎo)致了在MSI研究中需要進(jìn)行脫蠟等前處理。用于MALDI-MSI的福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE)組織切片制備的一般步驟包括:組織分離、固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、清洗、抗原回收、胰蛋白酶消化、基質(zhì)噴涂[32]。圖4為對(duì)FFPE組織進(jìn)行MALDI MSI肽分析的工作流程[33]。Hermann等[34]優(yōu)化了溶解胰蛋白酶的溶劑條件、胰蛋白酶的濃度、脫蠟后的清洗過(guò)程、胰蛋白酶和基質(zhì)的噴涂等步驟,用于腎臟、心臟和血管組織的FFPE切片,標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序可以提高從不同實(shí)驗(yàn)室獲得數(shù)據(jù)的可靠性。

Paine等[35]開(kāi)發(fā)了一種能夠從FFPE組織中檢測(cè)內(nèi)源肽的方法。他們通過(guò)MALDI-MSI分析了30年前用福爾馬林固定包埋石蠟中的美洲蟑螂的神經(jīng)內(nèi)分泌組織,揭示了20多種肽的組織學(xué)定位。該方案的樣品前處理使用二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟處理,省略了清洗、抗原回收以及會(huì)干擾MSI對(duì)低豐度內(nèi)源肽檢測(cè)的酶消化步驟,實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)源性肽的高通量質(zhì)譜成像分析。膠原蛋白和彈性蛋白是所有組織和器官的基本框架,它們的表達(dá)和翻譯后修飾在生命活動(dòng)中受到嚴(yán)格的調(diào)控。Angel等[36]使用膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶代替常見(jiàn)的胰蛋白酶來(lái)消化FFPE組織中的膠原蛋白和彈性蛋白,并使用MALDI-MSI檢測(cè)消化產(chǎn)物,獲取膠原蛋白和彈性蛋白的空間定位。

2 質(zhì)譜成像在乳腺癌中的應(yīng)用

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)[37]。因此,建立早期診斷和有效篩查方法能提高乳腺癌患者的生存率。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,質(zhì)譜成像技術(shù)為腫瘤的研究和診斷提供了新的思路,它是一種研究生物組織或細(xì)胞中分子組成及分布的新型分析技術(shù),此方法可在無(wú)需標(biāo)記的前提下同時(shí)檢測(cè)腫瘤組織中多種物質(zhì)的分布。近年來(lái),研究者們?yōu)榱烁玫靥剿髻|(zhì)譜成像在乳腺癌中的應(yīng)用,主要分為3種模型來(lái)進(jìn)行研究:以乳腺癌細(xì)胞為模型的研究,以乳腺癌動(dòng)物為模型的研究,以臨床腫瘤樣本為模型的研究。

2.1 細(xì)胞模型

3D細(xì)胞微球是腫瘤研究中不可或缺的體外研究工具,此模型在評(píng)估抗腫瘤藥物的滲透和代謝方面有很好的應(yīng)用前景。多項(xiàng)研究成果表明2D和3D細(xì)胞體系存在微環(huán)境間的差別。Yue等[38]利用納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)2D和3D結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)模型的蛋白組進(jìn)行比較,結(jié)果表明細(xì)胞在3D培養(yǎng)狀態(tài)下體內(nèi)的增殖和擴(kuò)張速度不如2D培養(yǎng)快,3D培養(yǎng)能更好地反映體內(nèi)條件。Vidaysky等[39]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),在2D和3D培養(yǎng)模型中評(píng)估乳腺癌細(xì)胞的脂質(zhì)分子代謝情況。研究發(fā)現(xiàn)與2D細(xì)胞培養(yǎng)相比,3D細(xì)胞培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞總脂質(zhì)含量顯著下降,?；视团c膜脂的比值增加。此外,在惡性程度不同的3D細(xì)胞微球體中也存在顯著差異。因此,3D細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)更能反映細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和微環(huán)境的改變,通過(guò)這些脂質(zhì)分子的空間分布差異可以更好地了解脂質(zhì)代謝和癌癥之間的關(guān)系。

圖 5 MALDI-MSI檢測(cè)西妥昔單抗的示意圖[41]Fig. 5 Schematic illustration of cetuximab detection using MALDI-MSI[41]

表 4 不同離子源質(zhì)譜、3D模型及其檢測(cè)內(nèi)容

Hummon等[40]把MALDI-MSI技術(shù)應(yīng)用于HCT116結(jié)腸癌多細(xì)胞球狀體中,他們發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)結(jié)腸癌多細(xì)胞球狀體的滲透隨時(shí)間增加而增加,并且繪制出了藥物處理后3種代謝物(SN-38、SN-38葡糖醛酸苷、脫羧代謝物)在細(xì)胞球中的定位圖。他們還通過(guò)組織還原和MALDI-MSI分析,成功地繪制了西妥昔單抗在兩種不同結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29和DLD-1)微球中的時(shí)間依賴性滲透和空間分布[41],圖5為該實(shí)驗(yàn)的機(jī)理圖。此外,Tucker等[42]利用傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)、MALDI-MSI來(lái)探究乳腺癌細(xì)胞MCF-7球狀體和正常細(xì)胞的內(nèi)源性代謝物差異。他們可以根據(jù)代謝物標(biāo)記來(lái)判斷這些細(xì)胞培養(yǎng)模型的中心區(qū)域經(jīng)歷了缺氧加劇或者是氧化應(yīng)激。

質(zhì)譜成像技術(shù)在新藥開(kāi)發(fā)方面有很大的應(yīng)用前景。Feist等[43]利用多細(xì)胞腫瘤球狀體(multicellular tumor spheroids, MCTS)的空間異質(zhì)性來(lái)檢驗(yàn)藥物的分布,通過(guò)MALDI-MSI,利用HCT116結(jié)腸癌MCTS模型來(lái)評(píng)價(jià)表觀遺傳藥物UNC1999的作用。Theiner等[44]用了一種先進(jìn)的激光灼燒-電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICPMS)裝置,用于MCTS的高空間分辨率元素成像,他們測(cè)定了人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中的磷和鉑元素,即此方法可用于篩選金屬抗癌藥物。表4列舉了不同離子源質(zhì)譜和3D模型在不同癌癥中的檢測(cè)。

2.2 動(dòng)物模型

腫瘤的發(fā)生發(fā)展一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題,人類對(duì)腫瘤的起因、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等方面的分子機(jī)理尚不清楚。在腫瘤研究中,建立人腫瘤動(dòng)物模型是研究腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要手段。因此,合適的腫瘤動(dòng)物模型對(duì)于評(píng)價(jià)抗癌藥物及抗腫瘤免疫治療的療效至關(guān)重要。為了了解腫瘤的空間異質(zhì)性,Jiang等[45]對(duì)來(lái)自乳腺腫瘤異種移植的MDA-MB-231-HRE-tdTomato細(xì)胞的三維MALDI-MSI數(shù)據(jù)進(jìn)行線性判別分析,他們發(fā)現(xiàn)低氧調(diào)節(jié)蛋白在以下幾個(gè)途徑中表達(dá)上調(diào),如葡萄糖代謝、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊和翻譯等過(guò)程。此外,還發(fā)現(xiàn)一些特定的磷脂酰膽堿和鞘磷脂定位在腫瘤的缺氧區(qū),這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)可能會(huì)轉(zhuǎn)化為缺氧的潛在生物標(biāo)志物,可能會(huì)是潛在的治療乳腺癌的靶點(diǎn)。

同樣,為了了解缺氧帶來(lái)的腫瘤變化,Mascini等[46]以小鼠乳腺癌異種移植為模型,使用MALDI-MSI來(lái)研究哌莫硝唑及其代謝,他們證明了哌莫硝唑確實(shí)可以作為低氧標(biāo)記,這些標(biāo)記在臨床診斷和放化療方面有很大前景。Sun等[47]利用MSI方法來(lái)研究異種移植小鼠模型腫瘤組織中肉堿的空間分布變化,對(duì)17種左旋肉堿進(jìn)行成像,他們發(fā)現(xiàn)參與肉堿系統(tǒng)介導(dǎo)的脂肪酸氧化途徑的CPT 1A(carnitine palmitoyltransferase 1A)、CPT 2(carnitine palmitoyltransferase 2)和CRAT(carnitine acetyltransferase)在乳腺癌中異常表達(dá)。這也是人們首次發(fā)現(xiàn)CPT 2和CRAT在乳腺癌的表達(dá)中發(fā)生了變化。Reyzer等[48]以erbB受體抑制劑OSI-774和Herceptin處理后的HER2轉(zhuǎn)基因鼠為模型,采用MALDI-MSI進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)當(dāng)胸腺素β4和泛素下降超過(guò)80%時(shí),會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖抑制,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,此效應(yīng)具有時(shí)間和劑量依賴性。此外,他們還預(yù)測(cè)了OSI-774和Herceptin的協(xié)同治療效果以及耐藥作用,表明了基于MALDI-MSI的乳腺癌早期的蛋白質(zhì)組學(xué)變化可用于預(yù)測(cè)其臨床治療。Johnson等[49]以MCF-7乳腺癌異種移植小鼠為模型,采用UPLC-ESI-QTOF-MS(ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time-of-flight mass spectrometry)對(duì)其尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了酯葡萄糖醛酸、牛磺酸、香豆酸硫酸酯、癸酸葡糖苷酸等5種與乳腺癌相關(guān)的代謝物,其在腸道內(nèi)存在顯著性差異表達(dá),這些代謝產(chǎn)物的變化揭示了脂肪酸合成和腸道微生物與抗腫瘤增殖作用之間的相關(guān)性。Tanaka等[50]用定量質(zhì)譜成像技術(shù)分析了伊帕替尼在小鼠腦轉(zhuǎn)移區(qū)的濃度,發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的右旋糖苷在腦轉(zhuǎn)移區(qū)和腦實(shí)質(zhì)中熒光強(qiáng)度相當(dāng),表明血腫瘤屏障保持完整,伊帕替尼有望成為HER2陽(yáng)性乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的治療藥物。

2.3 臨床腫瘤樣本

隨著應(yīng)用分子診斷技術(shù)的發(fā)展,研究者們根據(jù)乳腺癌的基因表達(dá)譜不同,將其分為不同亞型[51]。目前基于雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)和ki-67等分子受體的表達(dá)將乳腺癌分為5種亞型,即管腔A型(luminal A)、管腔B型(luminal B)、HER2陽(yáng)性型、基底樣型/三陰性型以及其他類型。乳腺癌分子分型的研究對(duì)乳腺癌的個(gè)體治療和靶向治療有重要依據(jù)。

Kim等[52]采用MALDI-MSI鑒定臨床樣本中的內(nèi)源性雌激素,并成功檢測(cè)了芳香酶抑制劑處理的MCF-7細(xì)胞系中雌酮代謝表達(dá)水平的變化。因此,定量的MALDI-MSI方法有望成為含酮代謝物的靶向代謝組學(xué)的通用方法。Rauser等[53]利用MSI技術(shù)來(lái)探究HER2陽(yáng)性乳腺癌組織中的蛋白標(biāo)記物,對(duì)48例乳腺癌組織進(jìn)行質(zhì)譜成像分析,表明HER2狀態(tài)與特異性多肽/蛋白的表達(dá)相關(guān),其中一個(gè)富含半胱氨酸的小腸蛋白1(CRIP1)被認(rèn)為是與HER2過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)的蛋白之一,因此,它可以作為判斷HER2陽(yáng)性乳腺癌的特異性的標(biāo)記物之一。Scott等[54]采用MALDI-MSI方法,對(duì)人乳腺癌組織相關(guān)的N-glycan分布進(jìn)行評(píng)估。他們發(fā)現(xiàn)特定的聚糖結(jié)構(gòu)分布在基質(zhì)區(qū)、壞死區(qū)和腫瘤區(qū),一系列高甘露糖、分枝糖和巖藻糖基乳糖主要分布在腫瘤區(qū)域。此外,在晚期HER2陽(yáng)性、三陰性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中檢測(cè)到一系列乳糖胺聚糖。這些聚糖的發(fā)現(xiàn)為臨床的診療提供了新的思路,并可作為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。Prentice等[55]采用MALDI成像的胰蛋白酶肽來(lái)比較10個(gè)三陰性乳腺癌腫瘤組織的癌變區(qū)域和良性組織區(qū)域。通過(guò)分析編碼這14種蛋白的基因表達(dá)與三陰性乳腺癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)基因的高表達(dá)與較低的無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。相反,在雌激素受體陽(yáng)性的腫瘤中,這些基因的高表達(dá)與這些基因無(wú)相關(guān)性。該研究為三陰性乳腺癌相關(guān)生物標(biāo)記物的探索提供了新的認(rèn)識(shí),為乳腺癌的預(yù)后和治療提供了新的方向。

常壓敞開(kāi)式離子化質(zhì)譜可以在開(kāi)放環(huán)境下對(duì)樣品進(jìn)行解吸和離子化,且不需要復(fù)雜的樣品前處理。Calligaris等[56]發(fā)現(xiàn)DESI-MSI可以獲得具有代謝特征譜圖的分子圖像,并用來(lái)鑒別腫瘤組織和正常組織,有望將DESI-MSI應(yīng)用在保乳手術(shù)中,從而快速檢測(cè)殘余的癌組織。Santoro等[57]利用DESI-MSI識(shí)別出浸潤(rùn)性乳腺癌(IBC)、原位導(dǎo)管癌(DCIS)和相鄰的良性組織(ABT)之間以及乳腺癌分子亞型之間不同的脂質(zhì)成分。Robison等[58]利用DESI-MSI方法來(lái)鑒定乳腺癌細(xì)胞單層和懸浮培養(yǎng)(轉(zhuǎn)移性)中HER2/p53表達(dá)、轉(zhuǎn)移潛能和疾病狀態(tài)(即癌癥與非癌癥)的脂質(zhì)生物標(biāo)記物。此外,他們還利用DESI-MSI方法來(lái)繪制轉(zhuǎn)移性球狀體中脂質(zhì)的空間分布(MDA-MB-231),發(fā)現(xiàn)12種脂類與單層細(xì)胞培養(yǎng)的轉(zhuǎn)移潛能變化相關(guān),其中3種定位于球形壞死的核心,表明其在營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境中有促進(jìn)癌細(xì)胞存活的潛在作用。在單層MDA-MB-231培養(yǎng)中未檢測(cè)到的一種脂類物質(zhì)被定位到球體的外周,這表明它在浸潤(rùn)或增殖中發(fā)揮潛在作用。Mao等[59]利用AFAI-MSI (air flow assisted ionization-mass spectrometry imaging)通過(guò)分析脂質(zhì)來(lái)區(qū)分乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)和原位乳腺導(dǎo)管癌(DCIS)。他們發(fā)現(xiàn)多種亞型和組織結(jié)構(gòu)IDC和DCIS可以用AFAI-MSI進(jìn)行區(qū)分:IDC中磷脂含量高于DCIS,而DCIS中脂肪酸含量高于IDC,標(biāo)本的分類與組織病理學(xué)診斷的吻合度較高,證明此方法有望為臨床治療提供輔助診斷。

3 展望

乳腺癌作為女性最常見(jiàn)的腫瘤,受到人們廣泛的關(guān)注,不同亞型的乳腺癌一般具有不同的病情發(fā)展和結(jié)局,而如何區(qū)分不同的亞型一直以來(lái)是臨床上需要面對(duì)的難題。通過(guò)質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)乳腺癌進(jìn)行診斷為其提供了新的研究方向,但目前質(zhì)譜成像并未廣泛應(yīng)用到臨床診斷中,仍然處于起步階段。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,樣品制備、儀器控制、數(shù)據(jù)分析等仍然存在一定的改善空間。此外,采集大量樣品,開(kāi)展大范圍的實(shí)驗(yàn),才能為乳腺癌的診斷和治療帶來(lái)新的突破。