楊志敏, 張 文, 吳福祥, 王行智, 許曉輝

(蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院, 甘肅 蘭州 730050)

枸杞是茄科多年生落葉灌木,其干燥成熟果實枸杞子是國家衛(wèi)健委公布的藥食同源物質(zhì)之一[1]。枸杞中含有多糖、類胡蘿卜素、維生素、脂肪酸、酚類、黃酮等成分[2-4],豐富的營養(yǎng)深受廣大消費者喜愛,但也極易受到病蟲侵害。生產(chǎn)者為了確保產(chǎn)量,必須使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治,但是長期用藥會使一些害蟲和病原微生物產(chǎn)生抗藥性,農(nóng)戶常常采取加大農(nóng)藥濃度或者增加噴灑次數(shù)等方式對病蟲害進(jìn)行防治。這些不規(guī)范的用藥方式是造成農(nóng)藥殘留的主要因素。農(nóng)藥殘留問題不僅影響枸杞產(chǎn)品的質(zhì)量,給人體健康帶來安全隱患,目前也成為我國枸杞的出口貿(mào)易壁壘[5,6]。農(nóng)藥多殘留快速檢測方法的開發(fā)是市場監(jiān)管開展日常監(jiān)督檢驗和風(fēng)險評估的主要篩查技術(shù)。因此,建立枸杞基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留快速靈敏的檢測方法,對保護(hù)消費者的安全、推動枸杞產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前,枸杞中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)主要有氣相色譜法[7,8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]、液相色譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13,14]等。氣相色譜和液相色譜檢測技術(shù)定量準(zhǔn)確,但在農(nóng)藥多殘留測定時易受基質(zhì)干擾,在靈敏度和確證方面存在不足。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法可降低基質(zhì)干擾,在靈敏度和選擇性方面具有優(yōu)勢,已成為農(nóng)藥多殘留分析的主要方法。鑒于氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法高準(zhǔn)確性、高效性及基質(zhì)干擾小的特點,以及動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dMRM)模式檢測的高靈敏度、高選擇性和對色譜峰形改善等優(yōu)點,氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜結(jié)合dMRM,成為高通量篩查農(nóng)藥多殘留的首選方法。關(guān)于枸杞中農(nóng)藥殘留檢測方法的報道,目前涉及的農(nóng)藥數(shù)量最多為幾十種,雖然GB 23200.10-2016中檢測農(nóng)藥上百種,但是以傳統(tǒng)的固相萃取法進(jìn)行前處理,過程復(fù)雜耗時,不適用于快速篩查。QuEChERS前處理方法具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、簡便快速、準(zhǔn)確高效等特點,近年來已被廣泛用于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留的測定。

運用氣相色譜-質(zhì)譜儀的動態(tài)多反應(yīng)掃描模式監(jiān)測枸杞中的農(nóng)藥多殘留檢測方法鮮見報道。由于基質(zhì)的差異性,本文參考QuEChERS法測定果蔬中農(nóng)藥多殘留的國標(biāo)法[15],從提取、凈化等前處理條件結(jié)合氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀所備有的檢測功能,優(yōu)化出可同時快速測定枸杞中農(nóng)藥多殘留的檢測方法,為保證枸杞質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B-7000D氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);5810R高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司);VORTEX-5渦旋混勻器(中國其林貝爾儀器制造有限公司);A11基本型分析研磨機(jī)、KS501圓周振蕩搖床(德國IKA公司);MS205DU、BSA224S-CW電子天平(德國Sartorius公司);EVA32多功能樣品濃縮儀(北京普立泰科儀器有限公司);Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

118種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥95.0%,德國Dr. Ehrenstorfer公司、北京鄭翔科技有限公司);甲酸、正己烷、乙腈(色譜純,德國Merck公司);丙酮(色譜純,科密歐化學(xué)試劑有限公司);無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二鈉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)(美國Agilent公司)。

1.2 分析條件

色譜柱:HP-5MS UI氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:280 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;載氣:氦氣;流速:0.9 mL/min;程序升溫:初始溫度60 ℃,保持1 min,以40 ℃/min的速率升溫至170 ℃,再以10 ℃/min的速率升溫至310 ℃,保持3 min;進(jìn)樣量:1.0 μL,不分流進(jìn)樣。

離子源:EI源;離子源溫度:230 ℃;動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式;電子能量:70 eV;溶劑延遲:2.5 min;采集軟件:Agilent MassHunter。118種農(nóng)藥的質(zhì)譜條件具體見表1。

1.3 實驗方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取各供試標(biāo)準(zhǔn)品,據(jù)其溶解性用丙酮或正己烷分別配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃避光保存?zhèn)溆?混合標(biāo)準(zhǔn)溶液臨用前用正己烷稀釋。

1.3.2樣品前處理

取枸杞干果樣品,于-18 ℃冷凍48 h后立即粉碎,精密稱取5 g(精確至0.001 g)樣品,置于50 mL離心管中,加入10 mL超純水振蕩混勻,再加入10.00 mL乙腈劇烈振蕩10 min,于-18 ℃冷凍10 min,加入4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉、1.0 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉,立即渦旋混勻1 min,于4 ℃以3 900 r/min離心5 min,上清液待凈化。

精密移取6.00 mL上清液,移至內(nèi)含PSA 150 mg、C18150 mg、無水硫酸鎂800 mg的凈化管中,渦旋混勻1 min,于4 ℃以3 900 r/min離心5 min,精密吸取2.00 mL上清液，置于離心管中,于40 ℃水浴中氮吹至近干,加入1.00 mL正己烷復(fù)溶,過0.2 μm有機(jī)濾膜,待測定。

1.3.3基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取枸杞空白樣品,依照1.3.2節(jié)方法制備得到空白基質(zhì)溶液。臨用前用空白基質(zhì)溶液稀釋118種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表 1 118種農(nóng)藥的保留時間與質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

圖 1 枸杞基質(zhì)中118種農(nóng)藥的提取離子流圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 118 pesticides in the wolfberry matrix

圖 2 (a)加水量、(b)提取溶劑和(c)提取溫度對枸杞干果中118種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 2 Effects of (a) water addition, (b) extraction solvent and (c) extraction temperature on the recoveries of the 118 pesticides in dried wolfberry

2 結(jié)果與討論

2.1 dMRM模式下農(nóng)藥殘留檢測方法的建立

利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所(NIST)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索各個目標(biāo)農(nóng)藥的特征離子碎片和碰撞能量,通過多反應(yīng)監(jiān)測模式采集獲得每個化合物的保留時間,針對個別化合物采用自動或手動方式進(jìn)一步優(yōu)化,據(jù)已獲得的參數(shù)信息建立基于動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式的農(nóng)藥多殘留檢測方法。該檢測方法可以自動對保留時間窗口變化范圍進(jìn)行分配,進(jìn)而改善多種化合物的負(fù)載循環(huán)時間,提高分析靈敏度。動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式下118種農(nóng)藥的提取離子流圖(見圖1)。

2.2 提取條件的優(yōu)化

以枸杞干果為基質(zhì),在提取過程中分別從樣品加水量、提取溶劑以及提取過程中溫度的控制考察各個農(nóng)藥的提取效果。

2.2.1樣品加水量的考察

從含水量低的樣品中提取農(nóng)藥時,用溶劑直接浸提難以充分滲透到組織內(nèi)部,加入適量的水進(jìn)行復(fù)水處理有利于提高目標(biāo)農(nóng)藥的回收率。實驗比較了5、10、15、20 mL加水量對目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響(見圖2a)。結(jié)果表明,當(dāng)加水量為5 mL時,回收率小于70%的農(nóng)藥數(shù)量較多;當(dāng)加水量為10 mL時,回收率在70%～110%的數(shù)量最多;當(dāng)加水量超過10 mL時,回收率高于110%的農(nóng)藥數(shù)量明顯增多,且20 mL加水量的高回收率農(nóng)藥數(shù)量較15 mL加水量的多。因此,5 g枸杞干果中加入10 mL水時，各個農(nóng)藥化合物的提取效果最佳。

2.2.2提取溶劑的篩選

本實驗依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)[16]中涉及的農(nóng)藥目錄以及果蔬中常用農(nóng)藥選擇了有機(jī)磷、有機(jī)氯、三唑類、擬除蟲菊酯類和酰胺類等118種農(nóng)藥,由于農(nóng)藥種類多、極性差異不同,因此篩選適合大多數(shù)農(nóng)藥的提取溶劑尤為重要。對比了丙酮、正己烷、乙腈和含0.1%甲酸的乙腈(簡稱為酸化乙腈)4種溶劑提取后的溶液顏色,結(jié)果表明丙酮提取液顏色最深,正己烷次之,乙腈和酸化乙腈的提取液顏色相當(dāng)且較淺(見圖3),考慮對質(zhì)譜儀器的污染,以乙腈和酸化乙腈為宜。同時對目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行了回收率試驗,結(jié)果顯示采用正己烷時，農(nóng)藥的回收率整體水平偏低,可能是因為正己烷極性相對較弱,不利于極性較大農(nóng)藥的提取;其他3種溶劑(見圖2b)的農(nóng)藥回收率占比數(shù)量結(jié)果表明,當(dāng)提取溶劑依次為乙腈、酸化乙腈、丙酮時，回收率為70%～110%的農(nóng)藥數(shù)量逐漸減少；丙酮為提取溶劑時,回收率偏高或偏低的較多;酸化乙腈提取時有部分農(nóng)藥的回收率偏低,可能與農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)或酸堿性有關(guān),影響其提取效果。綜合考慮,以乙腈為溶劑可滿足大多數(shù)農(nóng)藥的提取效果。

圖 3 不同溶劑提取液的顏色對比Fig. 3 Color contrast of the different solvent extracts

2.2.3提取溫度的優(yōu)化

本實驗用乙腈溶劑提取后,參照QuEChERS法加入內(nèi)含4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉、1.0 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉的提取鹽包。氯化鈉可促進(jìn)溶液分層,緩沖體系可有效防止對酸堿敏感農(nóng)藥的降解,無水硫酸鎂在提取過程中可吸水,但是吸水會產(chǎn)生大量熱量,影響熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的回收率。本實驗對乙腈提取液分別采取常溫、-18 ℃冷凍10 min和20 min后加入緩沖體系提取試劑考察提取過程中溫度對提取回收率的影響。從圖2c可以看出,常溫下回收率大于110%的農(nóng)藥數(shù)量最多,-18 ℃冷凍10 min和20 min后農(nóng)藥的回收率在同一范圍內(nèi)的數(shù)量相當(dāng),從節(jié)約時間和經(jīng)濟(jì)方面綜合考慮,本實驗選取-18 ℃冷凍10 min為最佳提取溫度。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

枸杞中主要含多糖、類胡蘿卜素等物質(zhì),這些物質(zhì)會隨著目標(biāo)農(nóng)藥被一起提取,凈化處理可降低其對目標(biāo)化合物的干擾。果蔬中常用的凈化材料有PSA、C18、GCB和吸水劑無水硫酸鎂。PSA主要對極性有機(jī)酸、糖類和脂類產(chǎn)生吸附;C18主要去除脂類、類胡蘿卜素和葉黃素等色素;GCB主要去除葉綠素和極性小分子干擾物等色素,但對平面結(jié)構(gòu)目標(biāo)物具有很強的吸附性[17,18]。根據(jù)基質(zhì)中存在的干擾組分和前期實驗[13]基礎(chǔ),本實驗選擇無水硫酸鎂、PSA、C18考察其凈化效果。

2.3.1無水硫酸鎂添加量的優(yōu)化

在PSA 150 mg、C18100 mg的固定條件下,比較無水硫酸鎂用量(400、800、1 000、1 200 mg)對農(nóng)藥回收率的影響(見圖4a)。結(jié)果顯示,無水硫酸鎂用量400 mg時,低回收率農(nóng)藥數(shù)量較多;無水硫酸鎂用量800 mg時,回收率在70%～120%的農(nóng)藥數(shù)量占比最大；無水硫酸鎂用量為1 000 mg和1 200 mg時，偏低和偏高回收率的農(nóng)藥數(shù)量居多。綜合考慮,選取800 mg為無水硫酸鎂添加量。

2.3.2PSA添加量的優(yōu)化

在無水硫酸鎂800 mg、C18100 mg的固定條件下,對比100、150、200、400 mg PSA對目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響(見圖4b)。從圖中可以看出,PSA為100 mg時,低于70%回收率的農(nóng)藥數(shù)量最多;當(dāng)PSA為150 mg時,回收率在70%～120%的農(nóng)藥數(shù)量最多,當(dāng)PSA量超過150 mg時,偏高回收率的農(nóng)藥數(shù)量明顯增加。故本實驗PSA添加量采用150 mg。

2.3.3C18添加量的優(yōu)化

在無水硫酸鎂800 mg、PSA 150 mg的固定條件下,比較100、150、200、400 mg C18添加量對目標(biāo)農(nóng)藥凈化效果的影響(見圖4c)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):所有農(nóng)藥回收率均低于120%。C18添加量為100 mg和200 mg,回收率小于70%農(nóng)藥數(shù)量居多;C18為150 mg和400 mg時,同一回收率范圍的農(nóng)藥數(shù)量占比相當(dāng)。因此,考慮耗材用量,最終選取150 mg為C18添加量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

按照1.3.2節(jié)方法處理空白枸杞樣品,得到空白基質(zhì)溶液,然后配制成質(zhì)量濃度為20～640 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各個農(nóng)藥的峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),考察118種農(nóng)藥的線性關(guān)系。結(jié)果顯示,118種農(nóng)藥在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.992 3(見表2)。采用空白樣品添加方式考察118種農(nóng)藥的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10),檢出限為0.006～28.344 μg/kg,定量限為0.021～94.480 μg/kg,符合多數(shù)農(nóng)藥殘留篩查要求。

2.4.2加標(biāo)回收率與精密度

以空白枸杞樣為基質(zhì),添加0.01、0.04、0.10、0.20 mg/kg 4個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個加標(biāo)水平做6次平行實驗,采用優(yōu)化后的條件測定。結(jié)果顯示,118種農(nóng)藥平均回收率為64.97%～126.21%，RSD為0.69%～18.86%?？梢?該方法的準(zhǔn)確度和精密度較高,可用于測定樣品中多種農(nóng)藥殘留。

表 2 118種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表 2 (續(xù))

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是空白基質(zhì)匹配校正曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1。當(dāng)|ME|小于20%時,表示弱基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計;|ME|為20%～50%時,表示中等基質(zhì)效應(yīng);|ME|大于50%時表示強基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,82%農(nóng)藥的ME值為正值,呈現(xiàn)為基質(zhì)增強作用,18%的農(nóng)藥呈現(xiàn)基質(zhì)抑制作用(見圖5)。74%的農(nóng)藥表現(xiàn)出較弱的基質(zhì)效應(yīng),17%的農(nóng)藥具有中等效應(yīng),只有9%的農(nóng)藥為強基質(zhì)效應(yīng)。因此本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，可降低對目標(biāo)農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.6 樣品的測定

采用建立的方法測定了10批市售枸杞樣品中118種農(nóng)藥殘留,全部樣品均有農(nóng)藥檢出,單批樣本中檢出農(nóng)藥種類3～12種,共檢出農(nóng)藥22種,檢出率較高的有毒死蜱、氟蟲腈、氯氰菊酯、噠螨靈和苯醚甲環(huán)唑,其中有一批樣本中克菌丹含量達(dá)到1.406 6 mg/kg(見表3)?？梢婅坭皆诜N植過程中農(nóng)藥使用情況普遍存在,且使用的農(nóng)藥種類較多,今后需要相關(guān)部門加強監(jiān)管,嚴(yán)格控制枸杞生產(chǎn)過程中的用藥種類和劑量,提高產(chǎn)品質(zhì)量,保障用藥飲食安全。

圖 5 118種農(nóng)藥在枸杞干果中的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 5 Matrix effects of the 118 pesticides in dried wolfberry

表 3 10批樣品農(nóng)藥殘留的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文利用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了枸杞干果中多種農(nóng)藥殘留的高通量檢測方法,該方法前處理操作簡便、快速,基質(zhì)匹配標(biāo)曲法定量準(zhǔn)確,通過對實際樣品的測定,證實了該方法具有高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)點,適用于枸杞中農(nóng)藥多殘留的快速篩查與定量檢測,可為市場監(jiān)管的日常檢驗和產(chǎn)品質(zhì)量的風(fēng)險評估提供技術(shù)支撐。