譚欽月，王清吟，符瑞佳，周曉君，劉亞妹，王妹妹，林于金，呂 剛，梁 培

曼氏迭宮絳蟲(chóng)(Spirometramansoni, Sm)成蟲(chóng)通常寄生于貓、狗和人體的小腸中，一般不引起明顯的癥狀，但當(dāng)S.mansoni中期裂頭蚴感染人體時(shí)，則可引起嚴(yán)重的裂頭蚴病[1]。裂頭蚴病是一種因感染曼氏迭宮絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)——裂頭蚴(Sparganum)而導(dǎo)致的寄生蟲(chóng)病，呈全球分布，但在亞洲感染病例報(bào)道相對(duì)較多[2-3]。而在我國(guó)，該病主要在南方地區(qū)(海南、廣東、廣西、湖南等)分布，但近年來(lái)中部地區(qū)也有不少的病例報(bào)道[4]。在我國(guó)目前已經(jīng)有1 600多例病例，分別來(lái)自27個(gè)省、市、自治區(qū)[5]，并且報(bào)道病例呈逐年上升趨勢(shì)。人體感染裂頭蚴的主要途徑是通過(guò)食用半生的含裂頭蚴感染的青蛙肉、蛇肉或飲用含有原尾蚴的生水[6]而感染。

糖原作為大多數(shù)生物的主要能量?jī)?chǔ)存形式，是由葡萄糖殘基構(gòu)成的含許多分支的大分子多糖，其功能是儲(chǔ)存碳水化合物。糖原的降解和合成是通過(guò)糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase，GP)與糖原合成酶活性的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而其中GP是糖原分解代謝中的關(guān)鍵酶，通過(guò)切斷α(1→4)連接將糖原分子上的葡萄糖分子移除，從而催化糖原的磷酸化反應(yīng), 在糖原分解過(guò)程中起到了限速酶的作用。GP 通過(guò)降解糖原不僅產(chǎn)生了葡萄糖小分子為生物體提供能量，同時(shí)也維持著細(xì)胞的滲透壓平衡[7]。有相關(guān)研究報(bào)道，剛地弓形蟲(chóng)需要通過(guò)糖原磷酸化酶進(jìn)行支配淀粉的儲(chǔ)存，并導(dǎo)致腦囊腫[8]。在藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)研究中發(fā)現(xiàn)，糖原磷酸化酶可以通過(guò)調(diào)節(jié)糖原的儲(chǔ)存和降解從而在寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。有研究通過(guò)利用染料木黃酮對(duì)棘溝賴?yán){蟲(chóng)中糖原代謝中的糖原磷酸酶的抑制，能夠明顯的抑制寄生蟲(chóng)對(duì)葡萄糖的利用，從而達(dá)到影響寄生蟲(chóng)的生存[10]。曼氏迭宮絳蟲(chóng)的裂頭蚴寄生于第二中間宿主(青蛙、蛇)的肌肉部位，肌肉中主要的營(yíng)養(yǎng)成分是糖原，那么幼蟲(chóng)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所需要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源則是通過(guò)對(duì)糖原分解來(lái)獲取能量，為此糖原磷酸化酶對(duì)于裂頭蚴而言應(yīng)是極其重要的。而在曼氏裂頭蚴迭宮絳蟲(chóng)關(guān)于糖原磷酸化酶的研究尚屬空白，為此本研究從曼氏裂頭蚴中提取cDNA，從成蟲(chóng)文庫(kù)中調(diào)取SmGP的全長(zhǎng)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)功能域片段(fSmGP)克隆和蛋白的原核表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 由海南醫(yī)學(xué)院呂剛教授團(tuán)隊(duì)提供曼氏迭宮絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的全長(zhǎng)核苷酸序列。從天根生化科技有限公司購(gòu)得大腸埃希菌DH5α和BL21；全長(zhǎng)5 369 bp、兩端含His標(biāo)簽以及含有卡那霉素抗性的原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET-28α(+)由中山大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室贈(zèng)送。

1.1.2主要試劑 酵母提取物、胰蛋白胨和Trise-Base購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；T4-DNA ligase、限制性內(nèi)切酶BamH I與HindIII、預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；蛋白誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Sigma公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；脫脂奶粉等化學(xué)試劑購(gòu)于北京Solarbio公司。

1.2 方 法

1.2.1SmGP的生物學(xué)信息學(xué)分析 從基因組文庫(kù)中調(diào)取SmGP的全長(zhǎng)序列，利用ORF Finder確定該基因的開(kāi)放閱讀框。通過(guò)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLASTx程序，將編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；通過(guò)蛋白分析系統(tǒng)Expasy(www.expasy.org/)，分析SmGP蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；通過(guò)SWISS-MODEL軟件進(jìn)行SmGP的三維建模，B、T細(xì)胞表位位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)B、T細(xì)胞表位分析軟件(http://tools.immuneepitope.org/tools)預(yù)測(cè)SmGP序列中潛在的B、T細(xì)胞表位位點(diǎn)，以此來(lái)明確fSmGP；并由此來(lái)設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程有限公司合成引物，上游引物：5′-GGGATCCATGACTCTTGGTTTGGCTGCCTAT- 3′(下劃線為BamH I酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-GAAGCTTGAGGTAGGCCATGTTGACACG- 3′ (下劃線為HindIII酶切位點(diǎn))。

1.2.3基因的克隆 以曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴的cDNA為模板，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min：94 ℃變性45 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳下鑒定，并進(jìn)行DNA純化回收(按回收試劑盒的說(shuō)明)。利用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindIII對(duì)原核表達(dá)載體pET-28α(+)質(zhì)粒和擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，用DNA試劑盒純化得到純化產(chǎn)物，在T4連接酶作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coilDH5α感受細(xì)胞，鋪板培養(yǎng)。次日挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。將pET-28α-fSmGP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)，培養(yǎng)后的菌液送生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.4重組蛋白的表達(dá) 重組質(zhì)粒菌液(pET-28α-fSmGP)和空質(zhì)粒pET-28α(+)熱菌分別加入到含0.1%的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r/min，搖菌5 h；加入IPTG(終濃度1 mmol/L)繼續(xù)以37 ℃ 250 r/min搖菌3 h和5 h。將收集的菌液進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5Western blot鑒定 蛋白表達(dá)菌液進(jìn)行離心，收集沉淀進(jìn)行蛋白樣本處理，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，然后于冰水混合物中在電壓100 V條件下電泳1 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；在5%脫脂奶粉封閉4 ℃過(guò)夜；然后用PBS漂洗5次，每次5 min，再用1∶20 000稀釋的抗His單抗室溫孵育2 h；PBS漂洗后，室溫孵育HRP標(biāo)記的小鼠二抗(1∶5 000稀釋，PBS)，進(jìn)行DAB顯色3～5 min，出現(xiàn)條帶后立即用去離子水終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1SmGP核酸序列SmGP最長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 560 bp，共編碼519個(gè)氨基酸。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析，該蛋白屬于Glycosyltransferase-GTB-type超基因家族；并發(fā)現(xiàn)與SmGP基因編碼蛋白質(zhì)序列同源性最高的是細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus，CDS19686.1)一致性為89.98%，與人GP(肌型)(Homosapiens，AAC18079.1)的氨基酸序列一致性為70.93%，與小鼠GP(肌型)(Musmusculus，AAG00588.1)的氨基酸序列一致性為71.15%。

2.2SmGP蛋白質(zhì)理化性質(zhì)SmGP理論分子量和等電點(diǎn)分別為59.80 kDa、6.95，由C、H、N、O、S 5種原子共同組成。該蛋白的半衰期，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中、在酵母菌內(nèi)中和在大腸埃希菌中分別為30 h、>20 h和>10 h。消光系數(shù)反應(yīng)了蛋白在特定波長(zhǎng)下可吸收光或不可見(jiàn)光的能力可用于測(cè)蛋白濃度，該序列在280 nm的波長(zhǎng)下，當(dāng)二硫鍵全部打開(kāi)時(shí)為1.896，當(dāng)二硫鍵全部結(jié)合時(shí)為1.885。該蛋白GRAVY值為-0.397，即此蛋白質(zhì)呈現(xiàn)親水性。

2.3SmGP的磷酸化位點(diǎn) NetPhos分析顯示，該序列有潛在的磷酸化位點(diǎn)42個(gè)，但高于閾值(0.05)的只有32個(gè)位點(diǎn)，故預(yù)測(cè)該序列具有可行性的磷酸化位點(diǎn)應(yīng)處于32個(gè)，包含19個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)，磷酸化位點(diǎn)在N-端、中間區(qū)域和C-端都含有，且主要聚集在250～500氨基酸之間，如圖1所示。

圖1 SmGP的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.1 Phosphorylation site prediction for SmGP

2.4SmGP的二級(jí)結(jié)構(gòu) Secondary Structure分析顯示，SmGP二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋(47.98%)為主，β折疊為16.57%，無(wú)規(guī)則卷曲則占有35.45%。

2.5SmGP的三維空間結(jié)構(gòu)SmGP蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)表明GP為完全對(duì)稱的二聚體形式存在生物體內(nèi)，其中以白鏈顯示為蛋白的A鏈，藍(lán)鏈顯示的為蛋白的B鏈，以紅色顯示的是蛋白的起始位點(diǎn)，且起始點(diǎn)位置均暴露于空間外側(cè)，同時(shí)模型顯示SmGP有6個(gè)功能結(jié)合位點(diǎn)，葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)(粉色和紫色)、AMP結(jié)合位點(diǎn)(橙色和藍(lán)色)、磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)(黃色和灰色)如圖2所示。

圖2 SmGP的三維空間結(jié)構(gòu)Fig.2 Three dimensional structure of SmGP

2.6SmGP的B、T細(xì)胞表位位點(diǎn) 通過(guò)B細(xì)胞表位分析軟件顯示，SmGP可能存在10個(gè)潛在的B細(xì)胞位點(diǎn)，如表1所示。通過(guò)NetCTL顯示，該蛋白可能存在15個(gè)潛在的T細(xì)胞位點(diǎn)，在氨基酸序列100～400區(qū)域最為密集，如表2所示。結(jié)合B、T細(xì)胞的表位特點(diǎn)，選取氨基酸序列段在100～400區(qū)間的功能區(qū)域，進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，為進(jìn)一步對(duì)SmGP的研究奠定基礎(chǔ)。

表1 SmGP的B細(xì)胞表位Tab.1 B cell epitopes of SmGP

表2 SmGP的T細(xì)胞表位Tab.2 T cell epitopes of SmGP

2.7重組pET-28α-fGP質(zhì)粒雙酶切鑒定 利用特異性引物，運(yùn)用PCR技術(shù)從曼氏裂頭蚴的cDNA模板中擴(kuò)增出GP基因的功能域片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在800 bp附近有特異條帶，分子大小與理論值876 bp相一致。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)NCBI網(wǎng)站BLASTx程序，將PCR擴(kuò)增得到的fSmGP氨基酸序列與GenBank中的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，該蛋白屬于Glycosyltransferase-GTB-type超基因家族，說(shuō)明fSmGP擴(kuò)增成功。由HindIIII和BamHI雙酶后的重組質(zhì)粒，分別獲得的基因片段在800 bp和5 000 bp附近，與fSmGP的理論值876 bp和pET-28α(+)空載的理論值5 369 bp相一致，如圖3。測(cè)序結(jié)果表明插入序列與fSmGP的基因序列一致，上述結(jié)果說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M1：DNA Marker DL2000；1：由BamH I和HindIII雙酶切后的重組質(zhì)粒；2：pET-28α(+)空載質(zhì)粒：3：重組質(zhì)粒；M2：DNA Marker DL15000圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid for fSmGP expression by double enzyme digestion

2.8fSmGP蛋白的表達(dá)和鑒定 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，在37 ℃下分別誘導(dǎo)3 h、5 h，探索fSmGP蛋白表達(dá)的最佳條件。12%SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示如圖4，在略大于35 kDa的位置上均出現(xiàn)特異的蛋白條帶，條帶的分子量大小與預(yù)測(cè)的fSmGP蛋白質(zhì)分子38 kDa大小一致(因含有His標(biāo)簽)，且pET-28α(+)空載質(zhì)粒誘導(dǎo)前后均無(wú)此蛋白，提示此蛋白可能為fSmGP。同時(shí)，在上述條件下，1號(hào)和2號(hào)的含有fSmGP重組質(zhì)粒的大腸埃希菌在37 ℃ 5 h誘導(dǎo)條件下最佳。Western blot結(jié)果顯示如圖5，重組蛋白能被His單克隆抗體識(shí)別，識(shí)別得到條帶均在34～43 kDa之間，與預(yù)測(cè)分子量38 kDa相符合，結(jié)果表明成功誘導(dǎo)獲得fSmGP蛋白。

M：Protein Marker；1：未經(jīng)誘導(dǎo)的大腸埃希菌pET-28α(+)載體；2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸埃希菌pET-28α(+)載體；3：1號(hào)重組質(zhì)粒大腸桿菌未誘導(dǎo)；4：1號(hào)重組質(zhì)粒大腸桿菌經(jīng)37 ℃誘導(dǎo)3 h；5：1號(hào)重組質(zhì)粒大腸桿菌經(jīng)37 ℃下誘導(dǎo)5 h；6：2號(hào)重組質(zhì)粒大腸桿菌未誘導(dǎo)；7：2號(hào)重組質(zhì)粒大腸桿菌經(jīng)37 ℃誘導(dǎo)3 h；8：2號(hào)重組質(zhì)粒大腸桿菌經(jīng)37 ℃下誘導(dǎo)5 h；圖4 重組pET-28α-fSmGP融合蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of recombinant pET-28α-fSmGP protein

M：Protein Marker；1：重組蛋白與His單克隆抗體反應(yīng)條帶圖5 fSmGP的western blot鑒定Fig.5 Identification of fSmGP by western blotting

3 討 論

本文進(jìn)行SmGP蛋白理化性質(zhì)分析，可得知其在體外有較好的穩(wěn)定和具有較好的親水性，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主。有研究發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)，GP常以GPa和GPb兩種形式存在，分別呈活化狀態(tài)(R狀態(tài))和鈍化狀態(tài)(T狀態(tài))，而GP的失活和活化的轉(zhuǎn)化，在GP的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)中：其主要是取決于磷酸化作用和去磷酸化作用的速率，GP的Ser殘基可被磷酸化修飾，使無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變成有活性狀態(tài)；在本文的生物信息學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，該蛋白以二聚體的形式存在并且氨基酸序列中含有19個(gè)潛在的Ser磷酸化位點(diǎn)和SmGP分子中存在2個(gè)AMP結(jié)合位點(diǎn)。在GP的別構(gòu)調(diào)節(jié)中，AMP是別構(gòu)活化劑，通過(guò)改變其構(gòu)象，促使其由T形式轉(zhuǎn)變?yōu)镽形式[11-13]。由此可推測(cè)SmGP的活性調(diào)節(jié)位點(diǎn)為Ser磷酸化位點(diǎn)和AMP結(jié)合位點(diǎn)。在空間建模圖中顯示，分子中的6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均分布在整個(gè)分子表面，這有利于分子發(fā)揮活性功能作用。

SmGP屬于Glycosyltransferase-GTB-type超基因家族，與其他絳蟲(chóng)、人類氨基酸序列的同源性較高，因此，該蛋白全長(zhǎng)序列在作為診斷分子和疫苗開(kāi)發(fā)方面均沒(méi)有太大的價(jià)值。全長(zhǎng)序列中，B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位較為集中的分布在于100～400氨基酸的區(qū)域。為此，本實(shí)驗(yàn)選取了基因序列同源性較低且B、T細(xì)胞較為密集的區(qū)域，同時(shí)也是磷酸化位點(diǎn)較為集中的區(qū)域進(jìn)行基因克隆和蛋白表達(dá)。

曼氏裂頭蚴主要寄生于青蛙或蛇的肌肉部位，也可寄生于人體的皮下組織、眼部、腦部等，均是葡萄糖含量較低而糖原主要分布的組織部位。此外，在本實(shí)驗(yàn)室其他課題組檢測(cè)分析感染裂頭蚴的青蛙組織和正常青蛙組織中，發(fā)現(xiàn)糖原含量存在顯著性差異，SmGP作為糖原分解的關(guān)鍵酶，那么其在裂頭蚴的營(yíng)養(yǎng)攝取和能量代謝方面肯定發(fā)揮了不可或缺的作用。目前臨床中用于抗寄生蟲(chóng)的藥物主要的作用機(jī)理是阻斷寄生蟲(chóng)的能量來(lái)源，為此，SmGP可能是一個(gè)有潛在研究?jī)r(jià)值的藥物靶點(diǎn)。本研究成功表達(dá)SmGP蛋白，為深入了解其結(jié)構(gòu)、功能及其在蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與糖代謝的規(guī)律等研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)