楊衛(wèi)紅，楊鶴飛，馮 云，章域震，潘 虹，王 娟

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的一種人獸共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病，病死率幾乎為100%，帶病毒犬仍然是人類狂犬病的主要傳染源[1]。我國狂犬病的大流行發(fā)生在上世紀(jì)80年代，90年代通過犬只的綜合管理和人用狂犬病疫苗的應(yīng)用，狂犬病得到控制，本世紀(jì)初開始新一輪的流行，近幾年全國各省份均有流行，發(fā)病總體呈下降趨勢[2]。云南省狂犬病的流行趨勢與全國狂犬病流行基本相似，2018年全省16個州(市)中有14個合計發(fā)生狂犬病21例，仍處于大范圍流行[3]。RABV核蛋白(nucleoprotein，N)基因或糖蛋白(glycoprotein，G)基因的系統(tǒng)進化分析表明，我國的RABV可劃分為6個進化群(China-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)，各省有不同的分布[4-5]。以往研究顯示，云南境內(nèi)流行的RABV進化群可分為YN-A、YN-B、YN-C和YN-D，并依次屬于China-Ⅰ、China-Ⅵ、China-Ⅱ和China-Ⅲ[6]，RABV的遺傳多樣性提示云南省RABV來源的復(fù)雜性[7-11]。本研究對近10年人間狂犬病的流行特征、2015-2018年云南省RABV樣本N基因和G基因序列測定和系統(tǒng)進化進行分析，以闡明近期云南省狂犬病的流行和基因進化特征。

1 材料與方法

1.1資料收集 狂犬病病例資料源于中國疾病預(yù)防控制中心信息系統(tǒng)，運用描述流行病學(xué)方法對全省狂犬病的疫情數(shù)據(jù)進行分析；人口資料來源于云南省各州、市統(tǒng)計局和網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)。

1.2樣本 收集2015-2018年云南省各地疾控中心和動物疫控部門送檢(云南省地方病防治所的病人)、病犬、可疑犬、病牛、病驢等腦組織標(biāo)本，經(jīng)直接免疫熒光法(Direct immunofluorescence assay，DFA)抗原檢測陽性的樣本，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3RABV核酸檢測 用QIAamp viral RNA mini kit(德國QIAGEN公司)提取病毒RNA，用Ready-To-Go You-Prime First-strand beads(Ge Healthcare,USA)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-polymerase chain Reaction, RT-PCR)檢測DFA陽性的組織標(biāo)本中RABV核酸，擴增引物N基因(1 353 bp)為：N127(5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′)和N829(5′-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3′)；N577(5′-AAGATGTGYGCYAAYTGGAG-3′)和NR-E(5′-GGATTGACRAAGATCTTGCTCAT-3′)。G基因(1 575 bp)為：G-20F(5′-CTCAAAAGACTCAAGGAAAGATG-3′)和G966R(5′-ATGACTAAGACGTCTGAAACTCAC-3′)；G822F(5′-TCAGCTAGTAAATCTACATGACTTTC-3′)和GR-85(5′-GAGGACTGTTAAATCCAGAGATC-3′)[12]。反應(yīng)體系依次加入Go Taq Green Master Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、去離子水18 μL、cDNA 5 μL，充分混勻。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4N基因和G基因片段的測序 1%瓊脂糖凝膠檢測擴增產(chǎn)物，陽性樣本由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。

1.5序列分析 測序結(jié)果使用DNASTAR 軟件包中的Seqman軟件對測序結(jié)果進行拼接和質(zhì)量分析；使用BioEdit(version 7.0.5.3)和ClustalX 1.8軟件進行核苷酸和氨基酸序列的比對；使用Gene DOC軟件進行核苷酸和氨基酸差異度分析；使用MEGA 5.05軟件完成基于Neighbour-joining(NJ)方法的進化樹繪制，Bootstrap值設(shè)定為1000。

2 結(jié) 果

2.1流行慨況 從2008-2018年，云南省共有828例狂犬病報道，全省發(fā)病率在0.046/10萬～0.285/10萬之間波動，年均發(fā)病率為0.164/10萬。11年均有病例報告，2010年病例數(shù)達到高峰，發(fā)病數(shù)為131例，發(fā)病率為0.285/10萬，往后幾年病例數(shù)逐年降低，2018年報告病例數(shù)21例，發(fā)病率為0.046/10萬，發(fā)病總體呈下降趨勢。

2.2 流行分布

2.2.1地區(qū)分布 狂犬病在云南省廣泛分布，2008-2018年全省16個州(市)中14個有該病的流行，疫情波及的縣(市、區(qū))達70多個，11年以來麗江、怒江無人間狂犬病病例報告。各地發(fā)病有明顯的差異，疫情主要分布在昭通、曲靖、文山和紅河，分別位于我省的滇東北、滇東和滇南地區(qū)，與相鄰的四川、貴州、廣西和越南毗鄰。近年來，邊境地區(qū)西雙版納、普洱等疫情較重。從發(fā)病地區(qū)的病例數(shù)上看，2008年僅有6個州(市)病例報告，即昭通、曲靖、文山、紅河、昆明和西雙版納，2009年玉溪、臨滄及2010年滇西地區(qū)的保山市相繼出現(xiàn)病例，2011-2014年疫情擴散到滇中地區(qū)的楚雄和大理，2016年滇西北地區(qū)的迪慶首次出現(xiàn)該病例，狂犬病幾乎分布在全省，病例有自東向西蔓延的趨勢(圖1)。從波及縣份數(shù)與該年發(fā)病數(shù)比值來看，全省129個縣，2008年總發(fā)病109例，波及20個縣，波及縣份數(shù)占總病例數(shù)的18.3%(20/109)；2010年波及縣份數(shù)占總病例數(shù)的34.4%(45/131)；從2010年后病例數(shù)逐年下降，但是波及縣份數(shù)在逐年上升，2018年波及縣份數(shù)占總病例數(shù)的85.7%(18/21)，11年來占比最高，說明疫情雖有下降趨勢，但疫區(qū)在相對擴大(圖2)。

圖1 2008-2018年云南省狂犬病疫區(qū)分布Fig.1 Rabies epidemic areas in Yunnan from 2008 to 2018

圖2 2008-2018年云南省狂犬病發(fā)病數(shù)和波及縣份數(shù)情況Fig.2 Rabies incidence and epidemic counties from 2008 to 2018

2.2.2季節(jié)分布 根據(jù)2008-2018年疫情資料顯示，云南省全年均有狂犬病發(fā)生。11年各月總發(fā)病來看，從1月份開始就有疫情報告，8月份病例數(shù)最多有100例，2月和4月份最低均為54例，極差為46，有4個月病例數(shù)在50～60例之間，4個月病例數(shù)在60～70例，6、7、8月出現(xiàn)病例的高峰，分別是95例、78例和100例。從季節(jié)來看，夏秋季節(jié)高發(fā)，春冬季節(jié)發(fā)病相對溫和。

2.2.3人群分布 2008-2018年男性發(fā)病數(shù)占發(fā)病總?cè)藬?shù)的72%(596/828)，女性發(fā)病數(shù)占28%(232/828)，男女發(fā)病數(shù)之比約為2.57∶1；發(fā)病年齡最大超過85歲，最小只有1歲，40～50歲年齡組發(fā)病最高，占發(fā)病總?cè)藬?shù)的22.71%，50～60歲年齡組次之，占總發(fā)病數(shù)的16.91%，從各年齡段發(fā)病構(gòu)成比來看，中年、青壯年為主要發(fā)病群體，兒童次之，老年人發(fā)病相對低；從職業(yè)分布看，絕大多數(shù)患者為農(nóng)民，占發(fā)病總?cè)藬?shù)的72.22%，其次為學(xué)生(中小學(xué)生為主)12.08%、兒童9.18%、工人(民工)3.99%及其它2.54%。

2.3核酸檢測結(jié)果 對2015-2018年DFA狂犬病毒抗原陽性的46份樣本進行RT-PCR檢測，N基因檢出陽性34份，G基因檢出陽性33份。

2.4進化分析 使用上述2015-2018年云南34個RABV的N基因(1 353 bp)和33個G基因(1 575 bp)核苷酸序列與來自GenBank的54株RABV國內(nèi)外參考株N基因核苷酸序列和40株G基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。圖3、4顯示，云南株可分為3個進化群，稱為YN-A、YN-B和YN-C，YN-A屬China-Ⅰ進化群，YN-B屬China-Ⅵ進化群，YN-C屬于China-Ⅱ進化群。此次參與研究的34個RABV N基因和33個RABV G基因均屬于YN-A進化群，YN-A包含了本次調(diào)查期間所有州(市)的病毒株，并與來自四川省的6株YN-A同在一個進化支中，親緣關(guān)系最為接近。

▲:2015-2018年狂犬病病毒云南株圖3 云南省2015-2018年34株狂犬病病毒N基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the N gene sequences of 34 rabies viruses in Yunnan from 2015 to 2018

▲:2015-2018年狂犬病病毒云南珠圖4 2015-2018年33株狂犬病病毒G基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the G gene sequences of 33 rabies viruses from 2015 to 2018

為了進一步闡明YN-A進化群病毒株間的進化關(guān)系及其與相鄰省份流行株間的進化關(guān)系，單獨使用YN-A病毒株與鄰省同屬China-Ⅰ進化群的9株RABV構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。圖3B顯示，雖然2015-2018年云南省YN-A病毒株均位于進化關(guān)系較近的大分支中，但不同年份或不同地區(qū)流行株間仍存在一定差異，并可分為多個進化亞支。如2015-2018年楚雄州各縣病毒株(祿豐CYN15156D、武定CYN17183D、祿豐CYN18186D、牟定CYN18188D)親緣性較近，并與四川省2009年流行株(JX005941)流行株最為接近。2015-2017年，滇西北地區(qū)大理、保山、迪慶、怒江流行株(云龍CYN15159D、隆陽區(qū)CYN17174D、維西CYN16168D、蘭坪CYN16167D)親緣性較近。2016年和2017年昭通4支(巧家CYN16164D、巧家CYN16166D、巧家CYN16165D、巧家CYN17176D)毒株同在一個小分支上，親緣關(guān)系比較密切。此外，楚雄州的流行株(大姚CYN16172D、姚安CYN15158D)和四川省的毒株(四川JX005943)同屬一個進化亞支，而與其他云南株關(guān)系稍遠(yuǎn)。

2.5同源性分析 使用34個云南RABV N基因序列進行同源性比較，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株間分別是99.2%～100%和99.1%～100%，33個G基因序列進行同源性比較，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株間分別是98.5%～100%和98.7%～100%。

3 討 論

云南省位于我國西南邊疆，北部和東部與狂犬病高發(fā)的四川、貴州和廣西省相鄰，西部和南部與國外狂犬病地方性流行的緬甸、老撾和越南相連，云南省狂犬病流行受到周邊地區(qū)疫情的一定影響[6，13-14]。云南省本輪狂犬病流行始于本世紀(jì)初，2010年達到高峰，隨后逐年下降[6]，從地區(qū)分布來看，中部、滇東和滇南地區(qū)流行不斷，2008年以來整個疫情從東向西蔓延，16個州(市)僅有2個未有病例報道，發(fā)病地區(qū)絕大多數(shù)在農(nóng)村，這可能與農(nóng)村地區(qū)犬只免疫覆蓋率低和暴露后處置不規(guī)范等因素有關(guān)；據(jù)季節(jié)分布和人群分布結(jié)果分析認(rèn)為，夏秋季節(jié)高發(fā)，春冬季節(jié)發(fā)病相對溫和，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]；男性患者多于女性，這可能與多數(shù)女性不太喜歡和犬只接觸有關(guān)；發(fā)病以青壯年農(nóng)民為主，其次是兒童和老人，農(nóng)村田間戶外的勞作多數(shù)為青壯年農(nóng)民，增加他們暴露的機會，兒童和老人的自我防護能力差，容易被犬攻擊。為進一步做好狂犬病的防控，須在農(nóng)村地區(qū)開展系統(tǒng)全面的狂犬病預(yù)防知識宣傳，鼓勵給家養(yǎng)犬注射疫苗且拴養(yǎng)，提高個人防護意識，政府和有關(guān)部門應(yīng)加強對犬只的管控。近年發(fā)病數(shù)雖有下降趨勢，但發(fā)病縣份數(shù)在增加，說明云南省狂犬病疫區(qū)廣泛存在。不同地區(qū)RABV流行株存在一定差異并具有地域特征，本次研究闡明云南各地RABV的分子生物學(xué)特征，對了解該病毒的進化和傳播有重要公共衛(wèi)生意義。

以往研究表明，云南RABV具有多樣性及傳播來源較為復(fù)雜的特點[16]，并存在YN-A、YN-B、YN-C和YN-D共4個進化群[6]。本研究對2015-2018年云南省各地州(市)的34個RABV N基因和33個G基因序列的進化和同源性分析，結(jié)果表明，此次的RABV均屬于YN-A進化群，說明YN-A已經(jīng)發(fā)展成為云南狂犬病流行的優(yōu)勢進化群，并基本闡明了該進化群的地區(qū)和時間分布特點及其與相鄰省份流行株的進化關(guān)系，為防控本病提供了重要的理論依據(jù)。

通過N基因和G基因進化分析表明，YN-A流行株廣泛分布于云南各州(市)流行區(qū)并貫穿于整個調(diào)查區(qū)間，在2015-2018年YN-A仍是云南RABV流行的優(yōu)勢進化群。YN-A屬于China-Ⅰ進化群，鑒于China-Ⅰ進化群為我國廣大地區(qū)尤其是云南相鄰省份的優(yōu)勢進化群[4，17]，認(rèn)為該進化群病毒是通過犬類流動由相鄰省份傳入滇東南和滇東北地區(qū)，并逐步向滇中和滇西方向擴散，如楚雄、大理、保山、臨滄、德宏、怒江和迪慶州(市)近幾年的疫情及本次各地樣本中檢測到的病原體均為YN-A。

本次研究顯示云南省2015-2018年34個N基因毒株和33個G基因毒株雖然親緣關(guān)系非常近，但各毒株間的地域分布和特征有一定差異。2016年我省滇西北迪慶地區(qū)第1次發(fā)現(xiàn)RABV(維西CYN16168D)，并與怒江州2015年分離的毒株(蘭坪KX096999)和2014年大理地區(qū)分離出的毒株(劍川KP202423)同在一個亞支上，表明該毒株是由于犬只的流動從大理地區(qū)傳入怒江，再由怒江到迪慶。從德宏地區(qū)提取出的2015年(瑞麗CYN15160D)和2018(瑞麗CYN18187D)兩株毒株與2015(梁河KT861585)毒株親緣關(guān)系較近，提示瑞麗毒株是由境內(nèi)相互傳播的結(jié)果，而非由緬甸地區(qū)傳進來的。各年份毒株間亦存在差異，2018年分離出的毒株間親緣關(guān)系較之前更近，說明RABV毒株無論是相似株之間或是處于不同分支上的毒株都不斷在進化。N基因序列和G基因序列的分析都可以看出，近年云南省內(nèi)的RABV毒株流行基本屬于境內(nèi)流行。

綜上所述，由于我國犬仍是目前狂犬病的主要傳染源，狗群的流動軌跡幾乎代表了RABV 毒株的傳播動向[18]，及時掌握我省RABV的分子生物學(xué)特征對本省狂犬病的防控具有重要的指導(dǎo)意義。在云南省進一步加強犬只的管理(包括登記注冊、疫苗注射、栓養(yǎng)等)和對帶毒犬的合理管制撲殺對狂犬病的預(yù)防控制起決定性作用。世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)研究表明，犬群免疫率達70%以上就能高效阻斷病毒的傳播鏈，故通過使用已批準(zhǔn)上市的狂犬病疫苗免疫犬只是消除狂犬病的重要途徑[18]。為完成全球2030年消除人間狂犬疫情的防控目標(biāo)，借鑒西歐消除狂犬病經(jīng)驗，還需落實更廣泛的公眾教育、預(yù)防控制狂犬病的傳播、創(chuàng)建分散的動物控制網(wǎng)絡(luò)和加強基于實驗室的監(jiān)測[4]。近年云南省農(nóng)村地區(qū)狂犬病發(fā)病占主導(dǎo)，在狂犬病的防治中應(yīng)將重點放在農(nóng)村和相對邊遠(yuǎn)落后地區(qū)。

利益沖突：無