劉 泓，岳蘭昕，邱麗珍，肖成榮，王淑美，周 維，高 月

(1．廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006;2．軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3．天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617)

含烏頭堿類中藥，如附子(烏頭的子根)、川烏(干燥母根)、草烏(干燥塊莖)、天雄等，早在東漢時(shí)期就已經(jīng)被《神農(nóng)本草經(jīng)》收錄藥用，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛功效，主治亡陽虛脫、肢冷脈微、心陽不足、腎陽虛衰、寒濕痹痛等病證，尤以附子為甚，常被譽(yù)為“回陽就逆第一品藥”[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，烏頭堿是附子中所含的一種C19-二酯二萜生物堿，具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心作用，但同時(shí)也兼具極強(qiáng)的心臟毒性和神經(jīng)毒性，特別是誘發(fā)的室性心律失常，被認(rèn)為是附子最重要毒副作用。因此，國家藥典對(duì)附子臨床藥用劑量(≤15 g)以及烏頭堿含量有嚴(yán)格的控制標(biāo)準(zhǔn)(≤0.02%)。

部分文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，烏頭堿作為附子主要藥效成分，其安全窗口狹窄，是0.25-4 μmol·L-1[2]。在此濃度范圍內(nèi)，低劑量烏頭堿可產(chǎn)生一定的正向肌力作用(強(qiáng)心)和抗炎功效。已有學(xué)者利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參附湯超微粉或炮制附子濃縮顆粒低劑量長(zhǎng)時(shí)間灌胃后，大鼠心臟等臟器中出現(xiàn)明顯的烏頭堿蓄積[3-4]。本課題團(tuán)隊(duì)前期工作首次證實(shí)，小劑量(≤10 μmol·L-1)烏頭堿持續(xù)給藥，蓄積的烏頭堿雖不會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞器質(zhì)性損傷，但可通過Notch1信號(hào)通路改變心肌細(xì)胞自身節(jié)律，存在潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)[5]。提示，即便是在現(xiàn)有安全劑量窗下，烏頭堿或含烏頭堿類藥物長(zhǎng)期使用，也會(huì)存在潛在慢性心臟毒性效應(yīng)。

為確保心肌細(xì)胞線粒體功能和形態(tài)的完備，每個(gè)細(xì)胞每4 min更新一個(gè)線粒體單位[6]。本團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)，烏頭堿(20 nmol·L-1-2.5 μmol·L-1)單次給藥即會(huì)造成線粒體更新循環(huán)加速，且干擾線粒體能量代謝過程[7]。但截至目前，尚無相關(guān)研究關(guān)注低劑量長(zhǎng)期或持續(xù)烏頭堿給藥后，心肌細(xì)胞線粒體能量代謝模式是否會(huì)產(chǎn)生明顯改變。

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSCs-CM)，具備人胚胎干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞類似的生理特性。此外，因克服種屬差異、易于體外長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)且適合高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)，hiPSCs-CM已成為藥物心臟毒效篩選的理想工具。鑒于烏頭堿種屬代謝存在一定差異，同時(shí)也為了更加真實(shí)反映含烏頭堿類中藥長(zhǎng)期服用過程中，低劑量烏頭堿對(duì)人體心肌細(xì)胞線粒體功能的影響，本文選擇構(gòu)建hiPSCs-CM開展后續(xù)相關(guān)研究工作[8]。本研究揭示線粒體能量代謝模式的改變，可能是低劑量烏頭堿慢性心肌毒性的作用靶點(diǎn)，為臨床安全劑量下長(zhǎng)期使用含烏頭堿類中藥提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑烏頭堿購于成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-17110910，純度98.01%。干細(xì)胞培養(yǎng)基mTeSRTMPlus(貨號(hào)05825)、STEMdiffTMCardiomyocyte Differentiation Kit(貨號(hào)05010)、STEMdiffTMCardiomyocyte Maintenance Kit(貨號(hào)05020)均購自加拿大Stemcell公司。Seahorse XF DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)103575-100)購自美國Agilent公司。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(貨號(hào)AT311)，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(貨號(hào)AQ101)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(Tab 1);Oct4A Rabbit mAb抗體(貨號(hào)2890S)，α-Actinin Mouse mAb抗體(貨號(hào)69758S)，Anti-mouse IgG(貨號(hào)8890S)均購自美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG(貨號(hào)ab150077，ab6721),山羊抗小鼠IgG(貨號(hào)ab6789)均購自英國Abcam公司。

1.2 儀器GeneAmp PCR System 2400型PCR儀(美國Applited Biosystem公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡LSM880 (德國ZEISS)；微電極應(yīng)用平臺(tái)(美國Axion BioSystems公司)；Seahorse XFe96 細(xì)胞代謝呼吸動(dòng)態(tài)分析儀(美國Agilent公司)；Opera Phenix 雙轉(zhuǎn)盤式共聚焦高內(nèi)涵分析系統(tǒng)(美國Perkin Elmer公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1.1人源心肌細(xì)胞AC16培養(yǎng) 由中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心彭雙清研究員團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng)(購于ATCC)。AC16細(xì)胞鋪板于含有10% FBS,105IU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，置于5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：① 正常對(duì)照組,② 烏頭堿1 nmol·L-1組,③ 烏頭堿10 nmol·L-1組,④ 烏頭堿100 nmol·L-1組,⑤ 烏頭堿1 μmol·L-1組,⑥ 烏頭堿10 μmol·L-1組。

1.3.1.2hiPSCs-CM誘導(dǎo)分化 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞hiPSCs購于北京賽貝生物技術(shù)有限公司。hiPSCs培養(yǎng)于mTeSRTMPlus中，復(fù)蘇后第3代開始進(jìn)行誘導(dǎo)分化。鋪板當(dāng)天記為d-2，在d-1更換新的mTeSRTMPlus培養(yǎng)基。確認(rèn)細(xì)胞融合度達(dá)到95%以上，分別在d 0、d 2更換含有添加因子A,B的分化培養(yǎng)基，d 4、d 6更換含有添加因子C的分化培養(yǎng)基。d 8-15，進(jìn)行維持培養(yǎng)。從d 8開始，誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞出現(xiàn)小幅度跳動(dòng)，d 15后，hiPSCs-CM誘導(dǎo)分化結(jié)束，可用于下游實(shí)驗(yàn)。

1.3.2免疫熒光 hiPSCs-CM設(shè)置正常對(duì)照組和給藥組，處理10 d。移去培養(yǎng)基，加入免疫染色固定液，室溫靜置10 min后，加入洗滌液靜置洗滌。加入封閉液，室溫封閉2 h。移去封閉液，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗，4 ℃靜置過夜?；厥找豢梗o置洗滌3次。加入適當(dāng)比例稀釋的二抗，4 ℃避光孵育2 h，靜置洗滌3次，最后加入含DAPI抗淬滅封片劑。

1.3.3qRT-PCR TRIzol法提取hiPSCs-CM RNA，定量檢測(cè)RNA濃度，合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件為94 ℃進(jìn)行2 min，94 ℃變性15 s，退火30 s(不同引物退火溫度見Tab 1)，72 ℃延伸20 s，循環(huán)進(jìn)行40次。采用△△Ct法分析Ct值，以2-△△Ct表示目的基因的表達(dá)量。

Tab 1 Primers involved in Real-Time PCR

1.3.4Western blot 移去培養(yǎng)基后加入100 μL細(xì)胞裂解液，用刮刀收集細(xì)胞，14 000g離心30 s提取蛋白。將收集管置于冰上，采用BCA定量法進(jìn)行定量。將定量變性后的蛋白進(jìn)行凝膠蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影，最后結(jié)果用ImageJ軟件處理。為獲得足量蛋白，此實(shí)驗(yàn)在AC16上進(jìn)行。

1.3.5微電極陣列記錄 將hiPSCs-CM鋪板到電極板上7 d后，采用Axion BioSystems 微電極應(yīng)用平臺(tái)檢測(cè)心肌細(xì)胞4個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)：收縮性、場(chǎng)電位(field potentials,FP)、胞外局部動(dòng)作電位(local extracellular action potential，LEAP)和搏動(dòng)傳播的基礎(chǔ)值(baseline)后，進(jìn)行加藥，在加藥后d 1、4、7、10讀取電信號(hào)。

1.3.6細(xì)胞能量代謝 提前5 h預(yù)熱檢測(cè)系統(tǒng),水化探針板。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，配制檢測(cè)液，細(xì)胞清洗后放入37 ℃無額外補(bǔ)充CO2的培養(yǎng)箱60 min等待上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過程中，注射終濃度分別為10 mmol·L-1葡萄糖、1.5 μmol·L-1寡霉素(oligomycin)，50 mmol·L-12-脫氧葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)、4 μmol·L-1羰基-氰-4-三氟甲氧基苯腙(Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，F(xiàn)CCP)、0.5 μmol·L-1抗霉素A(antimycin A)和魚藤酮(rotenone)。染色細(xì)胞核成像，采用Opera Phenix 共聚焦高內(nèi)涵分析系統(tǒng)對(duì)所得數(shù)據(jù)歸一化處理。

2 結(jié)果

2.1 hiPSCs培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為hiPSCs-CM按照Fig 1A所示，經(jīng)過為期15 d的誘導(dǎo)分化后，取未分化hiPSCs及分化后hiPSCs-CM進(jìn)行免疫熒光標(biāo)志物檢測(cè)。結(jié)果如Fig 1B所示，在hiPSCs中僅能檢測(cè)到干細(xì)胞特異性基因八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription-factor 4，Oct4)剪切變體OCT4A的表達(dá)，而缺乏心肌細(xì)胞標(biāo)志物輔肌動(dòng)蛋白(actinin alpha，α-Actinin)表達(dá)。hiPSCs-CM中可檢測(cè)到α-Actinin表達(dá)，而OCT4A未見表達(dá)；表明hiPSCs-CM誘導(dǎo)分化成功，可用于后續(xù)低劑量烏頭堿持續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)。

2.2 低劑量烏頭堿持續(xù)給藥對(duì)hiPSCs-CM機(jī)能的影響MEA檢測(cè)烏頭堿100 nmol·L-1持續(xù)給藥處理后hiPSCs-CM的收縮性、FP、LEAP和搏動(dòng)傳播的變化。如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，100 nmol·L-1烏頭堿持續(xù)給藥可導(dǎo)致hiPSCs-CM搏動(dòng)周期縮短，F(xiàn)P和LEAP時(shí)程均明顯縮短，傳導(dǎo)速度增加，興奮收縮延遲降低，但未見明顯的心律失常指征。結(jié)果提示，低劑量烏頭堿作用于心肌細(xì)胞，初期使其出現(xiàn)高頻收縮，產(chǎn)生強(qiáng)心功效，持續(xù)給藥后期雖未誘發(fā)心律失常，但使心肌收縮力降低。

2.3 低劑量烏頭堿持續(xù)給藥對(duì)hiPSCs-CM代謝表型的影響與對(duì)照組相比，hiPSCs-CM進(jìn)行100 nmol·L-1烏頭堿持續(xù)10 d給藥處理后，線粒體基礎(chǔ)氧耗、ATP合成能力與最大耗氧相應(yīng)增加(Fig 3A-D)，表明hiPSCs-CM的線粒體能量代謝功能增強(qiáng)；同時(shí)，抑制氧化磷酸化供能之后，烏頭堿給藥組利用糖酵解達(dá)到最大產(chǎn)生能量的能力增加(Fig 3E)；此外，烏頭堿可誘導(dǎo)糖酵解來源的ATP產(chǎn)生增加，能量表型分析也顯示能量產(chǎn)生向糖酵解方向偏移(Fig 3F、3G)。以上結(jié)果均提示，低劑量烏頭堿持續(xù)給藥后，hiPSCs-CM能量代謝方式向快速供能的糖酵解轉(zhuǎn)變，以滿足心肌細(xì)胞高頻搏動(dòng)的快速供能的需要。

Fig 1 The induced differentiation of hiPSCs to hiPSCs-CM A：Protocol of hiPSCs-CM differentiation and maintenance；B：Expression of hiPSCs pluripotency marker OCT4A (green) and hiPSCs-CM marker α-Actinin (red) after differentiation were detected by immunofluorescence.Nuclei were stained by DAPI (blue).

Fig 2 The changes of hiPSCs-CM functions after treated 100 nmol·L-1 aconitine for 10 consecutive days were recorded by MEAA：Contractility was represented by beat periods and beat amplitudes.**P<0.01 vs baseline (n=4)；B：Field Potentials;C：Local extracellular Action Potential;D：Propagation

2.4 低劑量烏頭堿長(zhǎng)期處理對(duì)hiPSCs-CM糖、脂代謝關(guān)鍵調(diào)控基因mRNA表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，100 nmol·L-1烏頭堿連續(xù)給藥10 d后，參與脂肪酸代謝的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(fatty acid transport proteins，F(xiàn)ATP)、乙酰輔酶a羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)表達(dá)均顯著降低(Fig 3H)；調(diào)控葡萄糖代謝的重要基因單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporter 1，MCT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(facilitative glucose transporters 4，Glut4)的表達(dá)也收到明顯抑制(Fig 3H)，但葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(facilitative glucose transporters 1，Glut1)表達(dá)無明顯變化，Glut1/Glut4含量比值顯著升高(Fig 3I)。提示，低劑量烏頭堿長(zhǎng)期持續(xù)給藥處理后，心肌能量代謝底物選擇發(fā)生改變，可能是烏頭堿誘導(dǎo)hiPSCs-CM能量代謝模式重構(gòu)的重要機(jī)制之一。

Fig 3 Effect of treatment with 100 nmol·L-1 aconitine for 10 consecutive days on energy metabolism and expression of genes of hiPSCs-CM were determined by seahorse and qRT-PCRA：Mitochondrial stress tests:representative hippocampal OCR curves of hiPSCs-CM.B，C and D：According to mitochondrial stress test curve,the OCR parameters were calculated,including basal respiration,ATP production and maximal respiration；E：Glycolysis stress tests:representative hippocampal ECAR curves of hiPSCs-CM；F：According to glycolysis stress tests curve,the ECAR parameter was calculated,including glycolytic capacity；G：Energy Phenotype Profile:The relative utilization of the two energy pathways of hiPSCs-CM is measured under both baseline phenotype and stressed phenotype conditions；H：The expression of genes were tested by qRT-PCR engaged in MCT1,Glut1 and Glut4 in glycolysis and ACC and CPT1 in lipid metabolism.*P<0.05,**P<0.01 vs control,n≥3.I：Glut1/Glut4 in control and 100 nmol·L-1 aconitine.##P<0.01,Glut1 vs Glut4.

2.5 低劑量烏頭堿持續(xù)給藥誘導(dǎo)hiPSCs-CM多能性增強(qiáng)Western blot和免疫熒光結(jié)果如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，給藥組c-Myc和OCT4A在低劑量組中(≤100 nmol·L-1)表達(dá)明顯增加，α-Actinin卻劑量依賴性降低(Fig 4A、B)。特別是OCT4A，免疫熒光結(jié)果也顯示在100 nmol·L-1烏頭堿組中表達(dá)明顯(Fig 4C)。表明低劑量烏頭堿持續(xù)給藥處理后，心肌細(xì)胞呈現(xiàn)多能性獲得的趨勢(shì)。

Fig 4 Expression of hiPSCs pluripotency transcription factors in hipscs-CM were detected after treated with low dose aconitineA，B：The protein levels of α-Actinin,SOX2,c-Myc and OCT4A in AC16 cells were detected by WB.*P<0.05,**P<0.01 vs control；C：Expression of hiPSCs pluripotency marker OCT4A (green) and hiPSCs-CM marker α-Actinin (red) in hiPSCs-CM after treated with low dose aconitine by immunofluorescence.Nucleus were stained by DAPI (blue).

3 討論

含烏頭堿類中藥對(duì)心力衰竭、心源性休克等危重病癥療效顯著。烏頭堿作為其重要藥效成分，主要通過誘發(fā)正向肌力作用發(fā)揮功效。但該二萜類雙酯生物堿安全窗口狹窄且心臟毒性顯著，稍過量極易誘發(fā)心律失常，甚至猝死等急性毒副作用[9]。目前，烏頭堿研究較為多集中在較大藥用劑量下引發(fā)的急性心臟毒性[10-11]，對(duì)安全劑量下長(zhǎng)期用藥風(fēng)險(xiǎn)研究甚少。本研究團(tuán)隊(duì)前期首次證實(shí)，小劑量烏頭堿持續(xù)給藥存在潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還首次發(fā)現(xiàn)安全藥用劑量下的烏頭堿可影響線粒體更新與能量代謝過程。這些前期工作均提示，在安全藥用劑量范圍內(nèi)，烏頭堿長(zhǎng)期用藥也存在慢性心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)，且線粒體可能是重要的毒性效應(yīng)靶點(diǎn)。

與之前的研究相一致[12]，本研究也證實(shí)低劑量烏頭堿持續(xù)給藥可誘導(dǎo)心肌出現(xiàn)高頻低幅的搏動(dòng)方式(搏動(dòng)周期縮短與收縮速度加快)，進(jìn)而產(chǎn)生正性肌力作用，但該過程中亟需心肌細(xì)胞快速提供充足的能量作為支撐。正常成熟心肌的能量供應(yīng)主要依靠游離脂肪酸β氧化所產(chǎn)生的ATP，該過程中核心環(huán)節(jié)是脂肪酸氧化產(chǎn)生的系列底物在線粒體中進(jìn)行氧化磷酸化。雖然，我們發(fā)現(xiàn)低劑量烏頭堿持續(xù)給藥后，心肌細(xì)胞線粒體能量代謝功能增強(qiáng)，但是其中糖酵解能量代謝水平增加顯著，反映心肌細(xì)胞的能量代謝表型逐漸從脂肪酸有氧氧化向糖酵解方向偏移。這可能與心肌快速收縮過程，能量供應(yīng)不足，氧耗較高，糖酵解供能方式更加直接、快速且節(jié)約氧有關(guān)。同時(shí)，通過分析糖、脂代謝調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化相關(guān)基因，如FATP、ACC、CPT1等被明顯抑制[13]，相反，Glut1等葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)無明顯影響，證實(shí)低劑量烏頭堿持續(xù)給藥可以通過影響底物選擇由脂肪酸向葡萄糖轉(zhuǎn)變，進(jìn)而改變心肌細(xì)胞能量代謝方式。

在心臟發(fā)育早期，幼稚心肌細(xì)胞供能方式主要是利用葡萄糖糖酵解產(chǎn)生ATP，此時(shí)心肌細(xì)胞中Glut1/Glut4約為1/2。隨著心肌逐漸分化成熟，Glut4比例明顯增加，Glut1/Glut4逐漸降低，心肌細(xì)胞糖酵解供能方式也相對(duì)弱化[14-15]。低劑量烏頭堿持續(xù)給藥后，hiPSCs-CM中Glut1/Glut4明顯增加，且出現(xiàn)多能性調(diào)節(jié)因子OCT4A表達(dá)增加、心肌骨架蛋白α-Actinin表達(dá)減少的現(xiàn)象，證實(shí)低劑量烏頭堿長(zhǎng)期給藥可誘導(dǎo)hiPSCs-CM多能性獲得，呈現(xiàn)一定的去分化狀態(tài)，此時(shí)心肌細(xì)胞能量代謝模式向“胚胎樣代謝模式”轉(zhuǎn)變，即糖酵解功能增加。有研究表明，無論是底物選擇改變還是多能性獲得導(dǎo)致的心肌細(xì)胞能量代謝模式重構(gòu)，雖可在短時(shí)內(nèi)保護(hù)心肌免受損傷，但長(zhǎng)此以往，此類模式與心衰過程中的能量代謝方式類似，可導(dǎo)致心肌纖維張力和韌性受到影響，不利于維持心肌發(fā)揮正常收縮功能[16]。因此，低劑量烏頭堿誘導(dǎo)的線粒體能量代謝模式重構(gòu)可能參與其慢性心肌毒性的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)低劑量烏頭堿持續(xù)給藥處理，可導(dǎo)致hiPSCs-CM的心肌能量代謝模式重構(gòu)，以滿足正向肌力作用所需能量。該過程中，烏頭堿誘導(dǎo)心肌細(xì)胞能量代謝底物選擇以及多能性獲得可能參與其中并發(fā)揮重要作用。因此，本研究為安全劑量下烏頭堿慢性心肌毒性確證與干預(yù)提供重要數(shù)據(jù)支持。