劉 燦,黃會珍,趙洪慶,鄒蔓姝,王葉情,李春艷，王宇紅,李強翔

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，中藥粉體與創(chuàng)新藥物國家重點實驗室培育基地/科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，寧夏 銀川 750001)

抑郁癥是一種常見的精神障礙疾病。這種疾病已經(jīng)影響了全球3億多人，我國抑郁癥發(fā)病率約為5.23%[1]。據(jù)統(tǒng)計近90 %的抑郁癥患者有睡眠障礙[2]，失眠是最常見的睡眠障礙之一，根據(jù)“精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊”第四版的標準，全球失眠率約為6%-10%[3]，已成為重大的公共衛(wèi)生問題。因此，有效的防治抑郁癥失眠對于抑郁癥的病程和結(jié)局有重要意義。

目前，抑郁癥失眠的發(fā)病機制尚未完全闡明，其發(fā)生可能與腦內(nèi)谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid，GABA)含量異常導(dǎo)致氨基酸的比值失衡有關(guān)[4-5]。本實驗陽性藥選擇文拉法辛和地西泮兩種西藥合用治療，使患者產(chǎn)生心理抵抗，且相較于西藥治療抑郁癥，中藥治療抑郁癥立足于整體調(diào)節(jié)、辨證論治，可實現(xiàn)多環(huán)節(jié)、多靶點、多途徑調(diào)控，具有標本兼治、療效明顯、安全有效等優(yōu)勢。復(fù)方柴金解郁片由柴胡、貫葉金絲桃和姜黃等中藥組成，具有“疏肝理氣、健脾養(yǎng)心、安神解郁”的功效，主要治療及預(yù)防肝郁脾虛、心神失養(yǎng)所致的輕中度抑郁癥伴有失眠。故本文通過慢性不可預(yù)見性輕度應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)聯(lián)合睡眠剝奪制作抑郁癥失眠大鼠模型，復(fù)方柴金解郁片進行干預(yù)，利用曠場、糖水偏好和戊巴比妥鈉閾上和閾下劑量實驗評價復(fù)方柴金解郁片對抑郁癥失眠模型大鼠行為學(xué)的影響，并從Glu/GABA比例失調(diào)方面評價其保護海馬和下丘腦的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級♂ SD大鼠72只，體質(zhì)量(180-220) g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房中，使用許可證號為SCXK(湘)2019-0009。實驗條件為：室溫(25±2)℃、房間相對濕度(50±5)%、保持12 h/12 h光暗周期，動物自由攝取食物與水。

1.2 試劑與儀器鹽酸文拉法辛緩釋膠囊(批號：AG6898A，規(guī)格：75 mg/粒)，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，生產(chǎn)廠家：Pflzer Ireland Pharmaceuticals，分包裝廠家：惠氏制藥有限公司；地西泮片(批號：181006，規(guī)格：2.5 mg/片)，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，生產(chǎn)廠家：山東信誼制藥有限公司；復(fù)方柴金解郁片浸膏(臨床成人生藥量為90 g·d-1,每克浸膏相當于3.92 g生藥)，由湖南中醫(yī)藥研究院提供；兔抗GABAAR多克隆抗體(批號：bs-4112R)、兔抗GAD67多克隆抗體(批號：bs-1302R)，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Glu酶聯(lián)免疫試劑盒(批號：20200505)；GABA酶聯(lián)免疫試劑盒(批號：20200505)，購自上海晶天生物科技有限公司。梯度PCR儀購自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；超微量核酸蛋白濃度測定儀購自英國Bio Drop公司；T10BS25型全自動勻漿儀購自德國IKA公司；ECO型PCR擴增儀購自美國illumina公司；Chemi Doc XRS+Imager型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.3 抑郁癥失眠模型的建立[6-7]d 1-14除空白組外均進行CUMS，包括:① 禁食24 h；② 禁水24 h；③ 4 ℃冰水浴4 min；④ 傾籠45 ℃；⑤ 噪音4 h；⑥ 潮濕墊料24 h(200 mL/籠)；⑦ 晝夜顛倒24 h；⑧ 電壓70 V，電流2 mA，足底電擊1 min；⑨ 夾尾1 min。每天1-2種刺激，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)。從d 15開始，進行多平臺水環(huán)境睡眠剝奪，根據(jù)前期對比觀察72 h快速睡眠剝奪和慢性睡眠剝奪這兩種方式，本實驗采用慢性睡眠剝奪，每天15 ∶00-9 ∶00(+1)進行18 h睡眠剝奪，連續(xù)21 d，剝奪箱為103 cm×56 cm×30 cm的玻璃水箱，箱內(nèi)置11個直徑為6.5 cm圓形平臺，大鼠在平臺上進入快動眼睡眠(rapid eye movement sleep,REMS)時全身的肌張力下降，頭部及毛發(fā)接觸到水面而不能完全入睡，達到睡眠剝奪的目的。正式造模前5 d對大鼠進行每天30 min適應(yīng)性平臺站立訓(xùn)練。睡眠剝奪箱上放有帶凹槽的不銹鋼絲制成的籠蓋，籠蓋上面可以放置飲用水和飼料，大鼠可自行飲水和攝食。失眠造模期間均不間斷抑郁造模。

1.4 分組與給藥采用CUMS聯(lián)合慢性睡眠剝奪的方法制備抑郁癥失眠大鼠模型，按體質(zhì)量采用隨機數(shù)字分組法分為6組，每組12只，分別為空白組，模型組，陽性藥組(鹽酸文拉法辛13.5 mg·kg-1+地西泮0.9 mg·kg-1)，復(fù)方柴金解郁片高(10.8 g·kg-1)、中(5.4 g·kg-1)、低(2.7 g·kg-1)劑量組，均為灌胃給藥?？瞻捉M和模型組給予等體積蒸餾水，其他組給予相應(yīng)供試品，1次/d，連續(xù)35 d，給藥體積10 mL·kg-1體質(zhì)量。

1.5 行為學(xué)實驗

1.5.1曠場實驗 采用80 cm×80 cm×40 cm的黑色敞箱，箱底用白線等分為25個正方形格子。將大鼠從中央一格放入，待適應(yīng)30 s后觀察記錄4 min內(nèi)大鼠水平活動次數(shù)、垂直站立次數(shù)和糞便粒數(shù)。每只鼠實驗結(jié)束后，用紙擦拭干凈并噴灑75%酒精，以免影響下一只鼠行為。

1.5.2糖水偏好實驗 在正式實驗前進行糖水嗜好訓(xùn)練，每只鼠籠放置2個相同規(guī)格飲水瓶。D 1兩瓶均為1%糖水，d 2換成1%糖水和雙蒸水各1瓶，隔1 h交換二者位置。D 3禁食禁水，24 h后進行糖水偏好測試。測試總時間為2 h，前1 h為左邊蔗糖水右邊蒸餾水，后1 h為左邊蒸餾水右邊蔗糖水。統(tǒng)計2 h內(nèi)大鼠蔗糖水消耗量，糖水偏嗜度/%=2 h內(nèi)蔗糖水總消耗量/(2 h內(nèi)蔗糖水總消耗量+2 h內(nèi)蒸餾水總消耗量)×100%。

1.5.3戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠睡眠實驗(1)戊巴比妥鈉閾上劑量觀察：每組取6只大鼠用于此實驗，閾上劑量為35 mg·kg-1。觀察各組大鼠翻正反射消失和恢復(fù)情況，記錄以下數(shù)據(jù)：① 注射戊巴比妥鈉時間；② 入睡時間：以1 min內(nèi)翻正反射消失為標準；③ 覺醒時間：以30 s內(nèi)翻正反射恢復(fù)為標準。計算入睡潛伏期和睡眠時長，入睡潛伏期=入睡時間-注射戊巴比妥鈉時間；睡眠時長=覺醒時間-入睡時間。(2)戊巴比妥鈉閾下劑量觀察：每組取6只大鼠用于此實驗，閾下劑量為18 mg·kg-1。記錄每組大鼠入睡只數(shù)。

1.6 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定行為學(xué)實驗后將各組大鼠迅速斷頭并于冰上取腦，分離海馬和下丘腦組織，液氮速凍，勻漿，離心后取上清液檢測Glu和GABA含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，本實驗使用的是雙抗體夾心法測定抗原。實驗過程按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.7 Western blot檢測取各樣本海馬和下丘腦，稱重，按RIPA裂解液+PMSF(蛋白酶抑制劑) ∶組織=5 ∶1勻漿，離心測定儀測定上清中蛋白濃度。取上清液，將上清液用PBS稀釋10倍后再進行測定。隨后，于SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)加入等量變性蛋白樣本，進行蛋白電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉1 h。并加入GABAAR、GABABR和GAD67，4 ℃過夜孵育一抗。稀釋比例為1 ∶800。次日，回收一抗，洗膜結(jié)束，加入二抗稀釋液(1 ∶2 000)，水平搖床室溫孵育1 h。最后，使用TBST溶液中，洗膜10 min×3次。并用ECL進行顯色。所得蛋白條帶的圖像分析采用ImageJ軟件。

1.8 qRT-PCR檢測取下丘腦、海馬樣本按50 mg加入1 mL TRIzol的比例進行冰上勻漿。按氯仿 ∶TRIzol=1 ∶5加入200 μL氯仿，離心15 min，勻漿液分為3層，上層水樣為RNA溶液，中間白色固體狀為DNA、蛋白質(zhì)，下層是有機層。吸取上層液體，加入同等體積異丙醇，離心15 min，EP管底部的片狀白色物質(zhì)即為RNA。加入50 μL 75 %乙醇吹打3次，加10 μL無酶水溶解，使用核酸蛋白濃度測定儀測定RNA濃度和純度。按Thermo試劑盒說明將將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按擴增試劑盒的說明對目的基因進行擴增。測定目的基因和內(nèi)參β-actin的PCR產(chǎn)物Cq值，待測基因的mRNA相對表達量采用2-△△Cq法計算。引物具體信息見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of target genes

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測

2.1.1曠場實驗 Tab 2結(jié)果顯示，d 14，與空白組相對比，模型組大鼠即表現(xiàn)出水平活動次數(shù)和站立次數(shù)減少，糞便粒數(shù)增加，有抑郁趨勢；d 35，與空白組相對比，模型組大鼠即表現(xiàn)出水平活動次數(shù)和站立次數(shù)減少(P<0.05或P<0.01)，糞便粒數(shù)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組大鼠自主活動次數(shù)增加(P<0.01)，糞便粒數(shù)明顯減少(P<0.05)，復(fù)方柴金解郁片高、中劑量組大鼠表現(xiàn)出自主活動增加(P<0.05或P<0.01)，糞便粒數(shù)減少趨勢。

2.1.2糖水偏好實驗 Tab 3結(jié)果顯示，d 14，與空白組相比，模型組大鼠糖水偏嗜度明顯減少(P<0.01)，有抑郁趨勢；d 35，與空白組相比，模型組大鼠糖水偏嗜度明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組大鼠糖水偏嗜度明顯增加(P<0.05)，復(fù)方柴金解郁片高、中劑量組大鼠糖水偏嗜度有所增加。

2.1.3戊巴比妥鈉閾上劑量作用實驗 Tab 4結(jié)果顯示，造模給藥期結(jié)束后，與空白組相比，模型組大鼠睡眠潛伏期明顯增長(P<0.01)，睡眠時長縮短(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和復(fù)方柴金解郁片高、中劑量組大鼠睡眠潛伏期顯著縮短，睡眠時長明顯增加(P<0.05或P<0.01)，低劑量組大鼠睡眠變化的趨勢不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.4戊巴比妥鈉閾下劑量作用實驗 Tab 4結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠在戊巴比妥鈉閾下劑量誘導(dǎo)下沒有動物入睡；與模型組比較，陽性藥組入睡率達66.67%，具有明顯提升(P<0.01)，復(fù)方柴金解郁片高、中劑量組與戊巴比妥鈉閾下劑量共同作用誘導(dǎo)大鼠入睡率分別為33.33%、50%，均有明顯提高(P<0.05或P<0.01)。

2.2 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量

2.2.1下丘腦中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量 Tab 5結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠下丘腦中Glu含量明顯升高，GABA含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，除復(fù)方柴金解郁片低劑量組外，其余各給藥組均能明顯逆轉(zhuǎn)Glu、GABA含量變化(P<0.05或P<0.01)。

2.2.2海馬中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量 Tab 6結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠海馬中Glu含量明顯升高，GABA含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥和復(fù)方柴金解郁片高、中劑量均能明顯逆轉(zhuǎn)Glu、GABA含量變化(P<0.05或P<0.01)，與上述下丘腦中結(jié)果一致。

Tab 2 Comparison of autonomous activity ability in n=8)

Tab 3 Comparison of sucrose water

2.3 GABA相關(guān)蛋白表達

2.3.1下丘腦中GABA信號相關(guān)分子蛋白表達 Fig 1、2結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠下丘腦GAD67、GABAAR、GABABR蛋白表達下降(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組大鼠下丘腦中各指標表達明顯升高(P<0.01)，復(fù)方柴金解郁片各劑量組對于各指標表達有提高作用。

Fig 1 Expression of GAD67,GABAAR,GABABR relative gray value of protein in hypothalamus of n=3)

Fig 2 GAD67,GABAAR,GABABR proteinexpression in hypothalamus of ratsA:Control;B:Model;C:Positive drug;D:High;E:Medium;F:Low

2.3.2海馬中GABA信號相關(guān)分子蛋白表達 Fig 3、4結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠海馬中GAD67、GABAAR、GABABR蛋白表達下降(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組大鼠海馬中各指標表達明顯升高(P<0.01)，復(fù)方柴金解郁片各劑量組對于各指標表達有提高作用。

Fig 3 Expression of GAD67,GABAAR,GABABR relative gray value of protein in hippocampus of

Fig 4 GAD67,GABAAR,GABABR protein expression in hippocampus of ratsA:Control;B:Model;C:Positive drug;D:High;E:Medium;F:Low

2.4 GABA相關(guān)分子基因表達

2.4.1下丘腦中GABA相關(guān)分子基因表達 Tab 7結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠下丘腦GAD67、GABAAR、GABABR mRNA表達下降(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組大鼠下丘腦中各指標基因表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)，復(fù)方柴金解郁片各劑量組均能提高各指標基因表達，中劑量效果最為顯著。

2.4.2海馬中GABA相關(guān)分子基因表達 Tab 8結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠海馬GAD67、GABAAR、GABABR基因表達下降(P<0.01)；與模型組比較，除復(fù)方柴金解郁片低劑量組外，各給藥組大鼠海馬中各指標基因表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

Tab 4 Comparison of hypnotic synergism of suprathreshold and subthreshold dose of pentobarbital min)

Tab 5 Comparison of Glu and GABA contents in rat

Tab 6 Comparison of Glu and GABA contents in rat hippocampus in each

Tab 7 Results of GAD67,GABAAR,GABABR mRNA in hypothalamus of rats in each

Tab 8 Results of GAD67,GABAAR,GABABR mRNA in hippocampus of rats in each

3 討論

睡眠障礙是抑郁癥標志性癥狀。異常的睡眠征兆包括慢波睡眠(slow wave sleep，SWS)減少或沒有，快速眼動(rapid eye movement sleep，REM)睡眠潛伏期縮短，睡眠覺醒時間增加，呈現(xiàn)更多的碎片化睡眠。目前，臨床上針對抑郁癥失眠的治療最為常見的是在使用抗抑郁藥基礎(chǔ)上合用鎮(zhèn)靜催眠藥，而針對GABA為治療靶點的抗抑郁癥失眠中藥藥物的研究十分有限。本課題組擬在前期復(fù)方柴金解郁片治療抑郁癥機制研究[8]的基礎(chǔ)上以期尋找能對抗抑郁癥失眠的創(chuàng)新治療藥物。因此，我們設(shè)計實驗研究復(fù)方柴金解郁片在神經(jīng)系統(tǒng)是否對CUMS聯(lián)合睡眠剝奪誘導(dǎo)的抑郁癥失眠有改善作用及其保護海馬和下丘腦的機制。

本實驗分別于抑郁造模14 d后和復(fù)合造模結(jié)束后對各組大鼠進行行為學(xué)評價，目的是確定復(fù)合模型大鼠在抑郁狀態(tài)前提下進行失眠造模，從而觀察復(fù)方柴金解郁片對大鼠抑郁樣和失眠行為的改善作用。曠場實驗結(jié)果顯示，復(fù)方柴金解郁片高、中劑量組相比于模型組大鼠活動度、對新鮮事物的好奇程度增加，警覺性降低，表明復(fù)方柴金解郁片能夠明顯增加抑郁癥失眠大鼠的興奮性和探究趨勢，緩解其緊張恐懼心理。糖水偏好實驗結(jié)果顯示復(fù)方柴金解郁片中劑量顯著提高了模型大鼠的快感程度。戊巴比妥鈉閾上和閾下劑量實驗是通過觀察受試藥物是否能延長戊巴比妥鈉的睡眠時間，判斷其是否有協(xié)同抑制失眠作用。本研究結(jié)果表明，復(fù)方柴金解郁片中劑量能夠縮短模型大鼠的睡眠潛伏期，延長大鼠的睡眠時間，提高大鼠的入睡率。綜上行為學(xué)實驗結(jié)果，提示復(fù)方柴金解郁片高、中劑量能緩解大鼠的抑郁失眠癥狀。

海馬是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic pituitary adrenal，HPA)軸負反饋的調(diào)節(jié)中樞，參與應(yīng)激的神經(jīng)內(nèi)分泌和情緒調(diào)節(jié)。下丘腦是HPA軸的一個重要神經(jīng)內(nèi)分泌中樞，其通過垂體控制內(nèi)分泌激素的釋放，從前到后分為3個部分：視上區(qū)、結(jié)節(jié)區(qū)、乳頭區(qū)，其中視交叉上核中的神經(jīng)元幾乎全部為GABA神經(jīng)元主要調(diào)控晝夜節(jié)律，參與抑郁癥失眠癥狀[9]。這兩個腦區(qū)被認為是抑郁癥失眠發(fā)病的關(guān)鍵靶區(qū)。

綜上，復(fù)方柴金解郁片能對抗Glu/GABA比例失衡引起的神經(jīng)元損傷，保護海馬和下丘腦，改善抑郁樣行為和失眠狀態(tài)。其神經(jīng)保護機制主要是下調(diào)興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、上調(diào)GABA通路相關(guān)分子GAD67、GABAAR和GABABR，從而加快神經(jīng)元成熟，促進神經(jīng)元修復(fù)，并最終改善抑郁失眠。