閆兆月,高玉帥,賈玉龍，步星耀

(河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科,河南 鄭州 450008)

腦膠質(zhì)瘤是一種顱內(nèi)常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的46%。目前，有關(guān)腦膠質(zhì)瘤的臨床治療主要是以手術(shù)療法、放療和化療為主，但是以上臨床療效不佳，病人預(yù)后較差，其原因是由于腫瘤細(xì)胞的惡性增殖并伴隨高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[1-2]。因此，通過抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力對(duì)于治療腦膠質(zhì)瘤具有積極的臨床價(jià)值。

miR-199a-5p在多種腫瘤細(xì)胞和組織中異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖代謝、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡等過程[3]。研究證實(shí)，在不同的腫瘤細(xì)胞中miR-199a-5p發(fā)揮不同生物學(xué)作用。在乳腺癌細(xì)胞MCF7，miR-199a-5p表達(dá)明顯下調(diào)，過表達(dá)miR-199a-5p能夠抑制自噬相關(guān)基因(Beclin1)表達(dá)，從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞自噬水平并抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[4]。另外，在結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-199a-5p負(fù)向調(diào)控FZD基因。FZD基因能夠影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化以及遷移等。miR-199a-5p能夠抑制FZD表達(dá)從而發(fā)揮抗癌作用[5]。以上研究表明[6]，miR-199a-5p在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)miR-199a-5p對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用尚不清楚。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoid domain receptor 1，DDR1)是一種非整合素膠原受體，廣泛參與細(xì)胞增殖、遷移和分化等生命活動(dòng)。在卵巢癌患者中DDR1在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制DDR1能夠降低卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移[7]。既往研究證實(shí)，miR-199a-5p靶向DDR1抑制大腸癌細(xì)胞增殖和遷移[8]。但是有關(guān)miR-199a-5p能否靶向DDR1抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移尚不清楚。因此，本研究擬通過構(gòu)建miR-199a-5p過表達(dá)U251細(xì)胞株，探究miR-199a-5p對(duì)其增殖和遷移的影響及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(中科院上海分院細(xì)胞庫)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone公司)；細(xì)胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白marker、BCA試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液和ECL發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)；miR-199a-5p和DDR1引物設(shè)計(jì)合成(上海生工生物工程股份有限公司)；DDR1一抗(美國Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：5583)；GAPDH一抗(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：AF5001)；CCK-8測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C0037)；Transwell小室(美國Corning 公司)；HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠、兔二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)；pcDNA3.1質(zhì)粒(BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心)；野生型DDR1-WT和突變型DDR1-MUT熒光素報(bào)告酶基因載體(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器單功能酶標(biāo)儀(湖南湘儀技術(shù)有限公司)；低溫、高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；PCR儀(山東博科科學(xué)儀器有限公司)；Western blot檢測(cè)裝置(美國Bio-Rad公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞使用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，待生長融合度達(dá)80%-90%時(shí)，傾去培養(yǎng)基，PBS潤洗2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化3 min至細(xì)胞呈卵圓形，10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，進(jìn)行傳代處理。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組(無轉(zhuǎn)染處理的U251細(xì)胞，24 h)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒U251細(xì)胞，NC)以及實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-199a-5p成熟模擬物，mimics)。另外，在細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%時(shí)，設(shè)置組別：轉(zhuǎn)染miR-199a-5p成熟模擬物組，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p成熟模擬物+DDR1空載體組(pcDNA3.1組)以及轉(zhuǎn)染miR-199a-5p成熟模擬物+DDR1質(zhì)粒組(pcDNA3.1-DDR1組)，以上各組轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)質(zhì)粒24 h后，收集各自細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力將消化后的U251細(xì)胞按照96孔板密度為：1×104/孔接種，細(xì)胞貼壁生長24 h后，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、miR-199a-5p NC組和miR-199a-5p mimics組，其中miR-199a-5p mimics組轉(zhuǎn)染miR-199a-5p 模擬物24 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。每孔加入5% MTT的溶液22 μL繼續(xù)室溫孵育2 h，酶標(biāo)儀設(shè)定波長為570 nm檢測(cè)各孔的吸光度值。

2.3 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力取對(duì)數(shù)生長期人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞鋪板，待各組細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長融合達(dá)到約100%時(shí)，采用3 μL微量移液槍頭在6孔板內(nèi)垂直劃痕。PBS潤洗3次后，采用無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后在顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)100倍視野內(nèi)拍照并計(jì)算各組劃痕后細(xì)胞遷移至空隙的細(xì)胞數(shù)目。

2.4 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力各組細(xì)胞首先采用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行吹打并計(jì)數(shù)，將上述細(xì)胞密度稀釋為108個(gè)·L-1，之后將上述細(xì)胞加入至Transwell小室內(nèi)，體積為200 μL，各自細(xì)胞數(shù)目保持為2×104個(gè)，下室中加入完全培養(yǎng)基500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24-48 h，傾去小室內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基，采用PBS潤洗2-3次，對(duì)于膜上方的細(xì)胞利用棉簽輕輕擦去，Transwell上下小室室溫條件下用4%的多聚甲醛固定約30 min，PBS潤洗2次，0.1%的結(jié)晶紫染色15 min，最后再次使用PBS潤洗2次。顯微鏡下觀察同一視野下5個(gè)位置的細(xì)胞數(shù)目，取各組平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)miR-199a-5p和DDR1 mRNA表達(dá)水平依據(jù)RNA提取試劑盒說明書步驟提取U251細(xì)胞總RNA，并運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成的 PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：92 ℃，30 s；92 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2-ΔΔCt值相對(duì)定量樣本中目的基因表達(dá)水平。

Tab 1 Primer sequences for RT-qPCR

2.6 Western blot檢測(cè)DDR1表達(dá)水平將處理完成的U251細(xì)胞放置于1.5 mL的組織研磨管內(nèi)并按照1 ∶4比例加入細(xì)胞裂解液放置在已經(jīng)預(yù)冷后的細(xì)胞組織勻漿儀中進(jìn)行研磨；4 ℃ 12 000×g離心10 min，收集細(xì)胞上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量檢測(cè)；每孔上樣量為30 μg進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，根據(jù)目的蛋白分子量大小以及蛋白Marker指示進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育DDR1(1 ∶100)，4 ℃過夜，孵育二抗(1 ∶5 000)1-2 h，于搖床搖晃洗膜，含吐溫磷酸鹽緩沖液(TPBS)洗滌后加入ECL，使用膠片曝光，圖片掃描后用 ImageJ 軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 miR-199a-5p轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics 8 h后，熒光顯微鏡下觀察U251細(xì)胞內(nèi)可見大量顆粒狀，部分顆粒可呈現(xiàn)細(xì)胞樣輪廓。表明miR-199a-5p mimics已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入U(xiǎn)251細(xì)胞(Fig 1)。qRT-PCR檢測(cè)各組miR-199a-5p表達(dá)水平顯示，與Control組相比，miR-199a-5p mimics組miR-199a-5p表達(dá)增加(P<0.01)，miR-199a-5p NC差異無顯著性(P>0.05)(Fig 2)。

Fig 1 Verification of miR-199a-5p transfection effect(40×)

Fig 2 The expression level of miR-199a-5p **P<0.01 vs control.

3.2 轉(zhuǎn)染miR-199a-5p對(duì)U251細(xì)胞增殖和遷移的影響分別采用CCK-8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251細(xì)胞增殖和遷移。CCK-8檢測(cè)顯示，與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics組細(xì)胞活力降低(P<0.01)(Fig 3A)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics組細(xì)胞遷移數(shù)目減少(P<0.01)(Fig 3B、3C)。Transwell實(shí)驗(yàn)，與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics組細(xì)胞遷移數(shù)目亦減少(P<0.01)(Fig 3D、3E)。以上結(jié)果表明miR-199a-5p能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖和遷移。

3.3 轉(zhuǎn)染miR-199a-5p對(duì)DDR1表達(dá)的影響qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251細(xì)胞DDR1表達(dá)水平。與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics組U251細(xì)胞DDR1 mRNA和蛋白水平均下調(diào)(P<0.01)(Fig 4)。

3.4 過表達(dá)DDR1逆轉(zhuǎn)miR-199a-5p模擬物對(duì)U251細(xì)胞增殖和遷移的影響為進(jìn)一步證實(shí)miR-199a-5p靶向DDR1抑制U251細(xì)胞增殖和遷移。通過構(gòu)建DDR1過表達(dá)細(xì)胞系，探究miR-199a-5p/DDR1在U251細(xì)胞增殖和遷移中作用。與Control組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DDR1組DDR1表達(dá)上調(diào)(P<0.01)(Fig 5A)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimincs組相比，過表達(dá)DDR1能夠促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖和遷移(P<0.01)(Fig 5B-5E)。

Fig 3 Effect of miR-199a-5p mimics on U251 cell A:The cell viability of U251 cells;B:Scratch assays were performed to test the migration ability of U251cells;C:Quantification of B;D:Transwell experiments were performed to test the migration ability of U251 cells;E:Quantification of D.**P<0.01 vs control.

Fig 4 Effect of miR-199a-5p mimics on DDR1 A:The expression of DDR1 mRNA.B:The expression of DDR1 protein.**P<0.01 vs Control.

Fig 5 Effect of overexpression of DDR1 on miR-199a-5p inhibiting proliferation and migration of U251 A:The expression of DDR1 protein.B:Scratch assays were performed to test the migration ability of U251cells.C:Quantification of B.D:Transwell experiments were performed to test the migration ability of U251 cells.E:Quantification of D.**P<0.01 vs miR-199a-5p mimics.

4 討論

miRNA是一類長度約20-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，其主要機(jī)制是與靶基因3′-UTR完全或是不完全配對(duì)，進(jìn)而降解靶基因mRNA或抑制翻譯，并參與機(jī)體的生長發(fā)育、增殖、分化等相關(guān)生命活動(dòng)[9]。miRNA在腫瘤的防治以及預(yù)后中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-199a是miRNAs中的一員，研究證實(shí)miR-199a在人體中是以miR-199a-5p和miR-199a-3p兩種成熟形式存在[10]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a在多種腫瘤進(jìn)程中扮演不同的角色，在卵巢組織以及相應(yīng)的細(xì)胞株中miR-199a表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-199a能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移以及血管形成[11]。然而，在胃癌組織miR-199a表達(dá)明顯高于癌旁正常的胃黏膜組織，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a表達(dá)水平與胃癌患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移成正相關(guān)[12]。在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，miR-199a-3p表達(dá)明顯下調(diào)，過表達(dá)miR-199a-3p能夠抑制p21蛋白激活激酶4表達(dá)進(jìn)而增加U251對(duì)化療的敏感性[13]。另外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-199a-5p表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-199a-5p能夠靶向抑制鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增殖、遷移和侵襲[14]。以上研究均表明，miR-199a-5p在膠質(zhì)瘤的進(jìn)程，尤其增殖和遷移中發(fā)揮關(guān)鍵的抑制作用。但是，有關(guān)miR-199a-5p對(duì)膠質(zhì)瘤增殖、遷移的分子作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究首先通過轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics 8 h發(fā)現(xiàn)U251細(xì)胞內(nèi)可見大量熒光顆粒狀，部分熒光顆?？沙尸F(xiàn)細(xì)胞樣輪廓。表明miR-199a-5p mimics已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入U(xiǎn)251細(xì)胞。進(jìn)一步qRT-PCR檢測(cè)各組U251細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)水平，結(jié)果顯示與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics組細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)明顯升高。

細(xì)胞異常增殖和遷移是膠質(zhì)瘤惡化的關(guān)鍵因素。CCK-8檢測(cè)顯示與Control相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics能夠明顯降低U251細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics組細(xì)胞遷移率明顯降低。本研究結(jié)果與以往文獻(xiàn)中miR-199a-5p抑制U251細(xì)胞增殖和遷移一致。DDR1是受體酪氨酸蛋白酶家族成員之一，廣泛參與了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移過程。既往文獻(xiàn)報(bào)道，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和臨床組織樣本中DDR1表達(dá)上調(diào)，DDR1抑制劑聯(lián)合化療能夠降低增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)化療藥物的敏感性[15]。另外，DDR1a能夠激活基質(zhì)金屬蛋白酶2誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤粘附和侵襲[16]。那么miR-199a-5p是否可以通過降低DDR1表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移呢？為此，本研究通過過表達(dá)miR-199a-5p發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p mimics組DDR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于Control。以往文獻(xiàn)通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-199a-5p能夠靶向DDR1 3′-UTR抑制DDR1表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖[17]。為進(jìn)一步確證miR-199a-5p能夠靶向DDR1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)通過在轉(zhuǎn)染miR-199a-5p的U251細(xì)胞中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DDR1，探究過表達(dá)DDR1能夠逆轉(zhuǎn)miR-199a-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用。Western blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1-DDR1組DDR1蛋白表達(dá)顯著增加，表明過表達(dá)DDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-199a-5p mimics組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DDR1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移降低。

綜上所述，本研究通過探究miR-199a-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p能夠靶向DDR1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。以上研究結(jié)果為膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的發(fā)生機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)，miR-199a-5p可能成為膠質(zhì)瘤治療的生物靶點(diǎn)，但是需要進(jìn)一步在動(dòng)物模型或膠質(zhì)瘤患者中確證。