孫凱琳，王毅鵬

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院 內(nèi)分泌科，云南 昆明650051；2.昆明市延安醫(yī)院 體檢中心，云南 昆明650051）

高尿酸血癥不僅是痛風(fēng)、高血壓和心血管疾病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，而且與代謝綜合征密切相關(guān)。由于人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，高尿酸血癥已成為一種常見的高發(fā)疾病，在我國發(fā)病率為13.3%[2]，同時(shí)我國人群高尿酸血癥遺傳也呈現(xiàn)出獨(dú)有特點(diǎn)。KCNQ1為糖尿病重要的易感基因，亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)KCNQ1與我國漢族人群痛風(fēng)相關(guān)[3]。KCNQ1與高尿酸血癥間的關(guān)聯(lián)研究甚少。為此，本研究采用SNaPshot 測(cè)序技術(shù)對(duì)KCNQ1基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)，進(jìn)一步探討其與高尿酸血癥的關(guān)聯(lián)及影響機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年3月—7月在昆明市延安醫(yī)院體檢發(fā)現(xiàn)的高尿酸血癥患者120 例（高尿酸血癥組），診斷參照該院檢驗(yàn)科標(biāo)準(zhǔn)：空腹血尿酸男性≥428 μmol/L、女性≥357 μmol/L。排除明確診斷的痛風(fēng)、高血壓、糖尿病、高脂血癥、感染、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤及其他系統(tǒng)疾病。選取180 例同期健康體檢者為對(duì)照組，排除標(biāo)準(zhǔn)同前。所有個(gè)體間無血緣關(guān)系，所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑

全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝公司），PCR 儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），電泳儀（北京六一儀器廠），3730XL 基因測(cè)序儀（美國Applied Biosystems 公司），血液基因組柱式小量提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），引物及金牌Mix（昆明擎科生物科技有限公司），SNaPshot試劑盒（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 基線資料收集

測(cè)量所有研究對(duì)象的身高、體重、血壓，并計(jì)算體重指數(shù)（BMI）。空腹?fàn)顟B(tài)下采集其外周靜脈血10 ml，置EDTA抗凝管和生化管各5 ml。取400 μl EDTA 抗凝血以提取DNA；生化管4 000 r/min 離心5 min 后，取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、葡萄糖（Glu）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、尿素、肌酐（Cr）及尿酸（UA）水平。

1.4 DNA提取及擴(kuò)增

使用血液基因組柱式小量提取試劑盒提取外周血基因組DNA，-20℃保存。根據(jù)GenBank 網(wǎng)站查找的KCNQ1基因序列設(shè)計(jì)并合成引物。KCNQ1基因rs179785 位點(diǎn)引物序列，正向：5′-GACCTATCCAG AAACAACGGCT-3′，反向：5′-GCTGAGAAAAGAC CCGCTTCA-3′；rs2283228 位點(diǎn)引物序列，正向：5′-CAGGGACTAGCACCCAAGAAG-3′，反向：5′-GGTTGGGAACTGCCTCATTCT-3′；rs2237892 位點(diǎn)引物序列，正向：5′-GGTCCTCAGAAAGTGCCAAG-3′，反向：5′-GGTAGGGAACAACTGGAGACAG-3′。擴(kuò)增體系：DNA模板1 μl、正反向引物（10 μmol/L）各2 μl、金牌Mix 45 μl；擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，共35 個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠、100 V 電壓下電泳30 min 后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，將條帶清晰的PCR 產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行SNaPshot分型檢測(cè)。

1.5 SNaPshot分型

磁吸法純化PCR產(chǎn)物，進(jìn)行單鏈延伸。rs179785位點(diǎn)延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCA TTAGCTCCTCCACGCC-3'；rs2283228 位點(diǎn)引物序列為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTACCCATCACG TTTAACCAG-3'；rs2237892 位點(diǎn)延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCACAGGACT TTGCCACC-3'。反應(yīng)體系：純化后DNA 模板1 μl，單鏈引物2 μl，ABI Snapshot multiplex Mix 2 μl；反應(yīng)條件：96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s，共25 個(gè)循環(huán)。取1 μl 延伸產(chǎn)物與10 μl 已加入120 LIZ 的甲酰胺（HIDI）混板，95℃變性5 min，置入-20℃冷凍2～3 min 后上機(jī)，用Genemapper 4.0軟件分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用χ2分割法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.017。采用Logistic 回歸模型分析各位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥的關(guān)聯(lián)，結(jié)果用風(fēng)險(xiǎn)比（）和95% CI 表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

兩組性別均按男女比3∶1 匹配，兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。兩組的BMI、收縮壓、舒張壓、ALT、AST、TG、HDL、尿素、Cr 和UA 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高尿酸血癥組的BMI、收縮壓、舒張壓、ALT、AST、TG、尿素、Cr和UA水平均高于對(duì)照組，HDL水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。兩組的Glu、TC、LDL比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組基線指標(biāo)的比較

2.2 電泳及SNaPshot分型結(jié)果

KCNQ1基因3 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增條帶見圖1。經(jīng)SNaPshot 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，rs179785 位點(diǎn)含AA、AG、GG 3 種基因型；rs2283228 位點(diǎn)含AA、AC、CC 3 種基因型；rs2237892 位點(diǎn)含CC、CT、TT 3種基因型。見圖2。

圖1 KCNQ1基因電泳圖

圖2 KCNQ1基因SNaPshot分型圖譜

2.3 兩組基因型和等位基因頻率分布

兩組KCNQ1基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（rs179785位點(diǎn)：χ2=0.048，P=0.827；rs2283228位點(diǎn)：χ2=0.053，P=0.817；rs2237892 位點(diǎn)：χ2=0.364，P=0.546），表明樣本代表性較好。兩組rs2283228、rs2237892 位點(diǎn)基因型分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)于rs2283228位點(diǎn)，高尿酸血癥組AC 基因型比例高于對(duì)照組，CC 基因型比例低于對(duì)照組（P＜0.017）。對(duì)于rs2237892 位點(diǎn)，高尿酸血癥組TT 基因型比例低于對(duì)照組（P＜0.017）。兩組rs179785 位點(diǎn)基因型分布及以上3 個(gè)位點(diǎn)等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2～4。

表2 KCNQ1 rs2283228位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率的比較 例（%）

表3 KCNQ1 rs2237892基因型分布及等位基因頻率的比較 例（%）

表4 KCNQ1 rs179785位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率的比較 例（%）

2.4 KCNQ1基因多態(tài)性與高尿酸血癥的關(guān)聯(lián)分析

以是否發(fā)生高尿酸血癥為因變量，本研究KCNQ1基因3 個(gè)位點(diǎn)各基因型及等位基因?yàn)閰f(xié)變量納入Logistic 回歸模型，發(fā)現(xiàn)無論是否調(diào)整性別、年齡、BMI 等混雜因素，rs2283228 位點(diǎn)AC 基因型均會(huì)增加高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，調(diào)整后[=4.027（95% CI：1.411，11.492）]（見表5）；rs2237892位點(diǎn)CT、TT 基因型及T 等位基因均會(huì)降低高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，調(diào)整后[=0.263 （95% CI：0.094，0.738）]、[=0.125（95% CI：0.024，0.647）]和[=0.309（95% CI：0.147，0.652）]（見表6）。以上關(guān)聯(lián)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。rs179785 位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥的關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表7）。

表5 rs2283228位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)

表6 rs2237892位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)

表7 rs179785位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)

3 討論

高尿酸血癥是由遺傳、環(huán)境因素共同作用引起的尿酸生成、重吸收增多或排泄減少，最終導(dǎo)致尿酸水平升高的現(xiàn)象，具有潛在的心臟代謝病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。KUWABARA 等[4]研究表明，無癥狀高尿酸血癥患者發(fā)展為肥胖、高血壓、血脂異常和慢性腎病的風(fēng)險(xiǎn)分別為正常人的3.2 倍、2.7 倍、1.6 倍和2.0 倍。本研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥組BMI、收縮壓、舒張壓、ALT、AST、TG、尿素和Cr 水平均高于對(duì)照組，而HDL 水平低于對(duì)照組，提示高尿酸血癥患者具有一定程度的肥胖、高血壓、血脂異常及肝腎功能受損傾向。

遺傳因素是高尿酸血癥發(fā)病的主要因素，但目前通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study,GWAS）確定的高尿酸血癥及痛風(fēng)易感基因僅能解釋5%～6%的血清尿酸鹽濃度變異[5]，提示更多位點(diǎn)有待發(fā)現(xiàn)。作為GWAS 新發(fā)現(xiàn)的痛風(fēng)易感基因，KCNQ1位于人類染色體11p15.5，長約400 kb，由17 個(gè)外顯子構(gòu)成。其編碼的KvLQT1 主要在心肌內(nèi)表達(dá)，內(nèi)耳、胃腸道、胰腺、肝腎和脂肪組織也有少量表達(dá)，對(duì)心臟動(dòng)作電位的復(fù)極和上皮組織水-鹽代謝均發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。KCNQ1基因突變將導(dǎo)致心臟緩慢激活K+通道的功能喪失，引起長Q-T 間期綜合征。大量研究表明，KCNQ1基因內(nèi)含子15處的rs2283228、rs2237892位點(diǎn)可影響不同地域人群對(duì)糖尿病的易感性：UNOKI 等[7]發(fā)現(xiàn)rs2283228與日本、丹麥人群糖尿病的發(fā)病相關(guān)；YASUDA等[8]則發(fā)現(xiàn)rs2237892 是日本人糖尿病的最強(qiáng)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)；SAIF-ALI 等[9]也發(fā)現(xiàn)rs2283228（A）和rs2237892（C）是馬來西亞人群糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因；而WANG 等[10]通過Meta 分析發(fā)現(xiàn)rs2237892 每攜帶一個(gè)C 等位基因，東亞人糖尿病的發(fā)病率將增加31.8%；CHEN 等[11]還發(fā)現(xiàn)rs2283228 位點(diǎn)CC 基因型和rs2237892 位點(diǎn)TT 基因型與我國東部地區(qū)人群TG水平升高相關(guān)；然而LIU 等[12]并未發(fā)現(xiàn)rs2237892 與我國北方女性代謝綜合征存在關(guān)聯(lián)。上述研究提示rs2283228、rs2237892 位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)糖脂代謝的影響具有種群特異性。

本研究發(fā)現(xiàn)，rs2283228、rs2237892 位點(diǎn)多態(tài)性同樣影響高尿酸血癥的易感性。其中高尿酸血癥組rs2283228 位點(diǎn)AC 基因型比例高于對(duì)照組（56.7% VS 41.7%），而CC 基因型比例低于對(duì)照組（7.5% VS 18.3%）。Logistic 回歸調(diào)整混雜因素后發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)攜帶AC 基因型的人群發(fā)生高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)為AA 基因型的4.027 倍，其關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示rs2283228 位點(diǎn)AC 基因型可能為高尿酸血癥發(fā)病的危險(xiǎn)因素。本研究還發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥組rs2237892 位點(diǎn)TT 基因型比例低于對(duì)照組（5.0% VS 14.4%）。Logistic 回歸調(diào)整混雜因素后發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)攜帶CT、TT 基因型發(fā)生高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)分別為CC 基因型的0.263 倍和0.125 倍，而攜帶T 等位基因發(fā)生高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)為C 等位基因的0.309 倍，其關(guān)聯(lián)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示，rs2237892 位點(diǎn)CT、TT 基因型和T 等位基因可能為高尿酸血癥發(fā)病的保護(hù)因素。既往研究表明，KCNQ1在維持細(xì)胞體積穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用，其在胞內(nèi)外電化學(xué)梯度的驅(qū)動(dòng)下，可促進(jìn)K+外流從而激活K+通道[13]。胞內(nèi)K+丟失的同時(shí)亦伴有Cl-和水分的丟失，引起近端小管上皮細(xì)胞體積減少甚至凋亡[14]，最終導(dǎo)致尿酸排泄障礙。因此，本研究推測(cè)rs2283228、rs2237892 位點(diǎn)影響高尿酸血癥發(fā)病的機(jī)制可能與K+通道激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

rs179785 是近年來鑒定的痛風(fēng)相關(guān)新位點(diǎn)，但本研究尚未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與高尿酸血癥的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其可能與高尿酸血癥的發(fā)病無關(guān)。LI 等[3]、王靜[15]在我國山東省人群中僅發(fā)現(xiàn)rs179785 等位基因頻率在痛風(fēng)和高尿酸血癥患者間存在顯著差異，亦未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與高尿酸血癥相關(guān)，故推測(cè)rs179785 位點(diǎn)可能通過高尿酸血癥以外的機(jī)制影響痛風(fēng)的發(fā)生。

本研究所探討的3 個(gè)KCNQ1基因位點(diǎn)，既往未見其與高尿酸血癥關(guān)聯(lián)的報(bào)道，因此具有一定創(chuàng)新性。本研究采用的SNaPshot 測(cè)序技術(shù)可一次性對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，具有經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、高效的優(yōu)點(diǎn)。本研究提示KCNQ1基因rs2283228 位點(diǎn)AC 基因型可能為高尿酸血癥發(fā)病的危險(xiǎn)因素，而rs2237892 位點(diǎn)CT、TT 基因型和T 等位基因可能為高尿酸血癥發(fā)病的保護(hù)因素。將來需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和進(jìn)行不同地域的研究，以期為高尿酸血癥及痛風(fēng)的早期篩查和藥物研發(fā)提供新靶點(diǎn)及其理論依據(jù)。