魯斌，黃曉宇，夏秀梅，尹小五

（孝感中心醫(yī)院 消化內(nèi)科2病區(qū)，湖北 孝感432000）

胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。其男性發(fā)病率在全球高居惡性腫瘤第4 位，病死率居第3 位，男性發(fā)病率是女性的2 倍。我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，根據(jù)2015年中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告，我國(guó)胃癌發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中均高居第2 位。目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的胃癌約90%處于進(jìn)展期，即使接受外科手術(shù)，5年生存率仍低于30%[1-2]。目前胃癌患者的生存期、預(yù)后及治療情況等雖然有所改善，但臨床治療晚期胃癌結(jié)果令人并不滿意，患者大多出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲，且術(shù)后5年生存率仍然較低，鑒于此早期診斷胃癌可改善臨床治療效果，有效減少患者病死率[3-4]。傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA），診斷胃癌的特異性、敏感較低，因此探索新的腫瘤診斷標(biāo)志物對(duì)臨床診斷胃癌至關(guān)重要[5-7]。microRNA（miRNA）由20～25 個(gè)核苷酸組成，是一種小分子的非編碼RNA，其調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)化，是許多生物過(guò)程如凋亡、侵襲、分化、增殖、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化上皮間充質(zhì)與血管生成等[8]的主要因素。監(jiān)測(cè)和檢測(cè)癌癥的潛在分子標(biāo)志物常被認(rèn)為是循環(huán)血液系統(tǒng)中微小RNA，這是因?yàn)槠湓谘獫{與血清中較穩(wěn)定且未被RNA 酶消化[9]。本研究應(yīng)用熒光定量PCR 法對(duì)332 例慢性胃炎及368 例胃癌患者血清microRNA-184（miR-184）與microRNA-20a （miR-20a）的應(yīng)答水平進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)的CEA 結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)這2 種miRNA 用于胃癌診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年5月—2019年5月孝感中心醫(yī)院住院收治368 例胃癌患者作為胃癌組。其中，男性232 例，女性136 例；年齡34～82 歲，平均59 歲；患者經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查或病理組織學(xué)檢查確診為胃癌，且初診為新發(fā)病例亦未接受過(guò)如放化療、免疫學(xué)治療、分子靶向目標(biāo)的治療等。排除胃部有轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者，其中180 例為Ⅳ期+Ⅲ期患者、188例Ⅱ期+Ⅰ期患者。另選取同期患有慢性胃炎的患者332 例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)病理組織學(xué)檢查并排除胃癌；②患者無(wú)其他腫瘤疾病史；③標(biāo)本采集前均未經(jīng)其他治療（如放療、化療等）。

1.2 樣本采集與RNA提取

對(duì)所有患者采集4 ml 全血，加入促凝劑使全血完全凝固，吸取上層500 μl 血清，采用無(wú)RNA酶的1.5 ml EP 管分裝，按照AM1556-mirVana?PARIS Kit試劑盒（美國(guó)Ambion公司）說(shuō)明書(shū)，從一部分血清樣本中提取RNA，采用u-2800 型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度和純度，并置于-70℃的超低溫冰箱中儲(chǔ)存；將采集的另一部分血液標(biāo)本送檢驗(yàn)科，采用2010 型全自動(dòng)電化學(xué)免疫分析儀（美國(guó)Roche Elecsys 公司）檢測(cè)血清CEA。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（美國(guó)ABI 公司）的使用說(shuō)明，用預(yù)冷的Trizo 研磨，倒入EP 管，加入三氟甲烷，離心，加入異丙醇，離心，加入乙醇，干燥揮發(fā)，加入RNase-free 水溶解RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的步驟進(jìn)行cDNA 合成。熒光定量采用RT-PCR 儀完成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，70℃退火30 s，60℃延伸30 s，擴(kuò)增循環(huán)40 個(gè)。miR-184 正向引物：5'-GGTAACGCCAGGGTTTTCC-3'，反向引物：3'-CCATTGCGGTCCCAAAAGG-5'，miR-20a正向引物：5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，反向引 物：3'-GTCCTTTGTCGAYACTGG-5'。以2-△△Ct法計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)，U6為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）表示，比較用秩和檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者不同臨床病理因素間血清miR-184和miR-20a表達(dá)水平的比較

胃癌患者血清miR-184 表達(dá)水平在臨床分期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著分期加重，下降程度加大，而在性別、年齡、有無(wú)飲酒史、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；胃癌患者血清miR-20a 表達(dá)水平在性別、年齡、有無(wú)飲酒史、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、臨床分期方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 胃癌患者不同臨床病理因素間血清miR-184和miR-20a表達(dá)水平的比較 （xˉ± s）

2.2 胃癌與慢性胃炎患者血清miR-184 和miR-20a表達(dá)水平的比較

熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，慢性胃炎組患者血清miR-20a 水平較胃癌組患者低（P＜0.05）；慢性胃炎組患者血清miR-184 水平較胃癌組患者高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者血清miR-184和miR-20a水平的比較M（P25，P75）

2.3 血清miR-184、miR-20a診斷胃癌的效果

使血清中miR-184、miR-20a 的表達(dá)水平聯(lián)合，按照風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，統(tǒng)計(jì)每位風(fēng)險(xiǎn)值或?yàn)榘┌Y的患者。通過(guò)分析對(duì)比各組ROC 曲線（見(jiàn)圖1）結(jié)果顯示，診斷胃癌采用血清miR-184，臨界值為10.35，敏感性88.4%，特異性為82.8%，曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.859（95% CI：0.808，0.912）；診斷胃癌應(yīng)用血清miR-20a，臨界值為4.24，特異性為71.7%，敏 感 性79.4%，AUC 為0.762（95% CI：0.692，0.166）；CEA 診斷胃癌臨界值為6 mg/ml，敏感性為69.3%，特異性為71.4%，AUC 為0.740（95%CI：0.668，0.811），相對(duì)較低；將血清miR-184、miR-20a聯(lián)合對(duì)胃癌進(jìn)行診斷的敏感性為84.7%，特異性為87.6%，AUC 為0.908（95% CI：0.868，0.949）。聯(lián)合血清miR-184 和miR-20a 對(duì)胃癌檢測(cè)的AUC 值較其他3種檢測(cè)方法高。見(jiàn)表3。

圖1 診斷胃癌的ROC曲線

表3 各診斷方法的相關(guān)參數(shù)

2.4 胃癌發(fā)生的相關(guān)影響因素

因變量為是否患有胃癌（0=對(duì)照組，1=胃癌組），納入184 例為統(tǒng)計(jì)分析對(duì)象，自變量為患者性別（1=女性，0=男性）、年齡（1=年齡＞50 歲，0=年齡≤50 歲）、血清miR-20a、miR-184 水平（1=血清miR-20a、miR-184 ＞2，0=血清miR-20a、miR-184 ≤2）及有無(wú)飲酒史（2=有飲酒史，0=無(wú)飲酒史），通過(guò)多因素Logistic 回歸分析，校正性別、年齡和飲酒后，結(jié)果顯示：血清miR-184 水平[=2.056（95%CI：0.417，0.722）]和miR-20a 水平[=1.012（95% CI： 1.697，6.875）]為胃癌發(fā)生的影響因素。見(jiàn)表4。

表4 胃癌發(fā)生相關(guān)因素的Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

miRNA 是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，其在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。到目前為止，在動(dòng)植物以及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有28 645 個(gè)miRNA 分子。有研究表明[10]，miRNA 參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝及細(xì)胞分化。此外，miRNA 水平的下降與慢性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)，提示miRNA 與癌癥可能有潛在的關(guān)系。目前生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)iRNA 參與細(xì)胞的發(fā)育、凋亡及其癌癥方面的關(guān)注已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)[12]。研究表明，胃癌組織中miRNA-106a 表達(dá)上調(diào)表達(dá)與腫瘤病變大小、分化、分期，以及浸潤(rùn)的深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密[13]。通過(guò)檢測(cè)胃癌和非癌組織中miRNA 的表達(dá)譜，并運(yùn)用多元回歸分析miRNA 的差異表達(dá)與預(yù)后間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞組織中miRNA 的異常表達(dá)是導(dǎo)致預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素[14]。

患者血清miR-20 a 的表達(dá)與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，或可作為胃癌的早期診斷指標(biāo)；LI等[15]對(duì)176胃癌患者手術(shù)標(biāo)本及癌旁正常組織進(jìn)行miR-184 的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-184 的表達(dá)下調(diào)，與胃黏膜非良性轉(zhuǎn)變、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)；ZHANG 等[16]對(duì)胃癌細(xì)胞系的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-184或可通過(guò)靶向調(diào)控鞘氨醇激酶1基因的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。YE 等[17]檢測(cè)87 例胃癌患者血清中miR-378和miR-21的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-378和miR-21聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌具有一定的診斷價(jià)值。

miRNA 在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。當(dāng)靶向miRNA 編碼癌基因或抑癌基因時(shí)，miRNA 的表達(dá)失調(diào)就會(huì)引起腫瘤的發(fā)生。miR-184可以通過(guò)直接靶作用于絲裂原活化蛋白激酶1，抑制胃癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，抑制其正常細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。本文通過(guò)檢測(cè)胃癌組患者與慢性胃炎組患者血清中miR-184、miR-20a 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-184表達(dá)水平下降，相比于慢性胃炎組患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其低表達(dá)很可能因其啟動(dòng)子區(qū)域CpG 島高度甲基化，并通過(guò)負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和絲裂原活化蛋白激酶1 的表達(dá)起到抑癌基因的作用。miR-20a在絕大多數(shù)胃癌組織中均高表達(dá)，被認(rèn)為是與胃癌相關(guān)的最重要的一種miRNA[19]。研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清miR-20 a 表達(dá)水平升高，與慢性胃炎組患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，程序性細(xì)胞死亡基因4能促使細(xì)胞凋亡，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因，miR-20 a 通過(guò)下調(diào)程序性細(xì)胞死亡基因4 的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，間接加快胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖速度[20]。進(jìn)一步分析胃癌患者血清miR-184、miR-20 a的表達(dá)與患者臨床病理因素關(guān)系表明，胃癌患者的miR-20 a表達(dá)水平在性別、年齡、飲酒史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但血清miR-184 在胃癌臨床分期中有差異，與前人報(bào)道結(jié)果一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-184 表達(dá)診斷胃癌的特異性比血清miR-20a表達(dá)的特異性高；聯(lián)合血清miR-184與miR-20 a 表達(dá)診斷胃癌的敏感性、特異性比單獨(dú)血清miR-184或血清miR-20 a表達(dá)升高。

綜上所述，胃癌患者血清中miR-184、miR-20a表達(dá)變化顯著，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，血清標(biāo)本較易獲取，而且血液中miRNAs分子相對(duì)穩(wěn)定，可作為分子診斷的理想標(biāo)志物，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但進(jìn)一步的臨床應(yīng)用還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。